SPECIFICS OF CAPTOPRIL DISTRIBUTION IN THE ORGANISM OF WARM-BLOODED ANIMALS (RATS)

Каптоприл ((2S)-1-[(2S)-3-Меркапто-2-метилпропаноил]-пирролидин-2-карбоновая кислота) – биологически активная субстанция, обладающая гипотензивной активностью и относящаяся к ингибиторам ангиотензинпревращающего фермента (АПФ)

Рассматриваемое соединение – это белый или почти белый кристаллический порошок, который легко растворим в метиленхлориде и метаноле, растворим в воде (160 мг/мл) и этаноле, плохо растворим в хлороформе и этилацетате, нерастворим в эфире

Исследуемое вещество обладает токсичностью для теплокровных организмов

LD50 составляет у крыс 4245 мг/кг при пероральном введении, 554 мг/кг – при внутривенном. В литературе описаны случаи отравления людей, в том числе с летальным исходом

Лекарственные средства группы иАПФ, к которым относится и каптоприл, широко применяются в медицине, в том числе для лечения заболеваний мочеполовой системы

Так как исследуемые соединения в большей степени выводятся из организма почками, то использование их у больных с нарушением выделительной функции может привести к увеличению токсичности. Кроме того, может изменяться картина распределения в организме.

Широкое применение каптоприла, наличие случаев летального отравления делает актуальным изучение его в химико-токсикологическом отношении.

Вместе с тем многие вопросы химико-токсикологического анализа каптоприла остаются недостаточно разработанными

Целью данной научной работы явилось изучение особенностей распределения каптоприла в организме теплокровных животных (крысы) с нормально функционирующей выделительной функцией почек и в условиях нарушения ее работы при летальных дозах лекарственного препарата, введенного перорально.

Объект анализа, используемый в настоящем исследовании – каптоприл ((2S)-1-[(2S)-3-Меркапто-2-метилпропаноил]пирролидин-2-карбоновая кислота) с содержанием основного вещества не менее 99.5%.

Особенности распределения каптоприла в организме теплокровных изучали параллельно на здоровых крысах породы Wistar и на крысах с поражением почек.

Для исследований отбирали 60 крыс-самцов 3-месячного возраста с массой тела 210-260 граммов. У части животных (30 особей) моделировали токсическое поражение почек. Для этого им вводили через зонд в желудок раствор ртути дихлорида из расчета 2 мг/кг. На третьи сутки делали вывод о нарушении выделительной функции почек по концентрации мочевины и креатинина. Концентрация мочевины составляла 130,4±11,2 мкг/г в организме здоровых крыс и 251,4±25,2 мкг/г в организме крыс с нарушением выделительной функции почек, концентрация креатинина – 13,1±1,7 мкг/г и 26,7±2,4 мкг/г соответственно.

25 крысам-самцам (здоровым или имеющим поражение почек), объединенным в 5 групп по 5 особей, вводили через зонд в желудок каптоприл в виде водной суспензии из расчета 12245 мг/кг (≈ 3 LD50). Через 1 час после введения животных подвергали эвтаназии. После гибели животных одинаковые органы и биожидкости, изъятые от особей внутри каждой группы, объединяли и изучали на наличие данного лекарственного средства. Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы, включающей 5 особей, которым в желудок вводили дистиллированную воду, не содержащую исследуемого вещества

В процессе исследования определённое количество биожидкости или ткани органа трупа, диспергированной до мелких (2-5 мм) частиц, обрабатывали ¾ часа двукратным по массе количеством смеси ацетон-метанол в соотношении 4:6 соответственно, проводя перемешивание через каждые 1/6-1/4 часа. Извлечение декантировали, биоматрицу повторно обрабатывали согласно методике новой порцией изолирующего агента. Второе извлечение объединяли с первым и испаряли смесь в токе воздуха комнатной температуры (18-22оС) досуха. Остаток обрабатывали, перемешивая, 3 раза по 1/20 часа фракциями по 5 мл смеси ацетон-метанол (4:6). Получаемые при этом растворы соединяли, растворители испаряли досуха в токе воздуха.

Остаток растворяли в 3-4 мл смеси изопропанол-вода (9:1) и в растворённом виде вносили в колонку 150×10 мм сорбента «Силасорб С-8» 15 мкм. Элюировали подвижной фазой изопропанол-вода (9:1). Фракции собирали по 2 мл, объединяли фракции, содержащие аналит, и испаряли досуха. Сухой остаток растворяли в 10 мл этанола, получая, таким образом, раствор для исследования.

В отдельные ёмкости (чашки фарфоровые на 25 мл № 1 и № 2) вносили 0,2-4,0 мл и 4,0 мл соответственно раствора для исследования. Растворитель испаряли.

Остаток в чашке № 1 подвергали обработке небольшим (0,2-0,3 мл) количеством этанола, а полученный раствор полосой наносили на пластину «Сорбфил» ПТСХ-АФ-В-УФ в область линии старта. Используя этанол как подвижную фазу, проводили параллельное хроматографирование аналита и вещества-свидетеля.

После элюирования аналита из неподвижной фазы проявленной хроматограммы этанолом поглощающую способность элюата исследовали в области «кварцевого» ультрафиолета.

Остаток в чашке № 2 растворяли в 4 мл подвижной фазы. 16 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Хроматографировали на приборе Agilent 1100 с УФ-детектором в колонке с обращённой фазой, элюируя полярной подвижной фазой.

Аналит идентифицировали по времени удерживания. Количество аналита определяли, исходя из площади хроматографического пика, используя уравнение градуировочного графика.

При идентификации методом ТСХ анализируемое вещество проявлялось на хроматограммах в УФ-свете в виде темного пятна на более светлом общем фоне пластины. Величина Rf его составляла 0,70±0,04, что соответствовало величине Rf стандарта каптоприла.

В процессе идентификации методом УФ-спектрофотометрии сравнение спектральных кривых каптоприла, извлечённого из органов животных и очищенного по вышеописанной схеме, со спектром чистого вещества в этаноле обнаруживалось совпадение формы спектральной кривой и положения точек экстремумов. Максимум определялся при длине волны 218 нм.

Результаты хроматографирования каптоприла в полупрепаративной колонке (150×10 мм) сорбента «Силасорб С-8» 15 мкм показали, что аналит в стандартных условиях проведения процесса содержится в 4 фракции (7-8 мл) элюата.

В контрольных опытах при исследовании извлечений из тканей органов крыс, не получавших каптоприл, установлено отсутствие в них данного вещества.

Измеренное при 218 нм (длина волны для определения аналита методами спектрофотометрии и ВЭЖХ) фоновое поглощение части элюата, соответствующего фракциям, в которых возможно присутствие рассматриваемого вещества, не превышало 0,026 (соответствует присутствию в 1 мл фотометрируемых растворов эндогенных соединений из 1 г одинаковых органов животных) (измерение в области аналитической длины волны).

При использовании ВЭЖХ применялась колонка Luna® 5 мкм C-18 100A 250,0×4,0 мм. Элюирование осуществляли смесью метанол-ацетонитрил-фосфатный буферный раствор с pH=3 (40:5:55 по объему) со скоростью 1 мл/мин при температуре термостата колонки 20°C. Аналитической являлась длина волны 218 нм.

При идентификации методом ВЭЖХ время удерживания анализируемого соединения совпадало с таковым вещества-стандарта и составляло 5,979 мин. На хроматограммах анализируемого вещества не обнаруживалось (по сравнению с хроматограммами вещества-стандарта) присутствие дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии.

Рассчитанное уравнение градуировочного графика для определения каптоприла методом ВЭЖХ имеет вид: S=1,351708∙С+1,082694 (S – площадь пика, С – хроматографируемое количество аналита, нг).

Относительная ошибка среднего результата при определении каптоприла методом ВЭЖХ находится в пределах ±1,1 % (n=6; Р=0,95).

Результаты определения каптоприла в органах отравленных животных со здоровыми почками и имеющих токсическое поражение почек представлены в табл. 1 и 2.

Содержание указанных таблиц позволяет заключить, что попавший через желудок в организм здоровых крыс каптоприл после наступления летального исхода от воздействия его тройной LD50 в значительной степени содержался (мг/100 г) в скелетной мускулатуре (125,7±10,9), миокарде (87,0±4,4), желудке и его содержимом (84,8±4,8) и крови (74,8±4,3) трупов животных. Меньшее присутствие каптоприла отмечалось в тонком кишечнике и его содержимом (53,9±3,4) и печени (34,1±2,8).

У погибших от отравления каптоприлом животных с поражением выделительной функции почек токсикант в значительной степени содержался в лёгких (384,4±61,2), тонком кишечнике и его содержимом (334,1±61,7), скелетной мускулатуре (329,9±38,6) и почках (264,9±21,0). Меньшее присутствие каптоприла отмечалось в крови (247,3±18,2) и печени (243,7±33,1).

Сравнивая характер локализации каптоприла в трупах здоровых животных и животных с токсическим поражением почек, можно заключить, что нарушение выделительной функции почек приводит к значительному увеличению присутствия токсиканта во всех исследованных органах.

Разработана схема исследования биоматериала на присутствие в нём каптоприла методами экстракции, спектрофотометрии и хроматографии (ТСХ, колоночная хроматография обычного давления, ВЭЖХ). Проведено изучение характера распределения каптоприла, введённого внутрижелудочно в количестве LD50×3, по органам и тканям здоровых теплокровных (крысы) и теплокровных с токсическим поражением функции почек. Выявлено, что преимущественными объектами содержания каптоприла в организмах здоровых животных (мг/100 г) явились скелетная мускулатура (125,7), миокард (87,9), желудок и его содержимое (84,8), кровь (74,8) и почки (62,7), а в организмах, имеющих почечную патологию, – лёгкие (384,4), тонкий кишечник и его содержимое (334,1), скелетная мускулатура (329,9) и почки (264,9).