POSTMORTEM DIAGNOSIS OF CHRONIC DRUG INTOXICATION BY ENZYME IMMUNOASSAY

В ходе производства судебно-медицинской экспертизы скоропостижной смерти одной из главных задач, особенно лиц молодого возраста наступившей в условиях неочевидности, является исключение острого отравления психоактивными веществами (ПАВ) или их употребления, а также выявление фактов злоупотребления ПАВ или наличия хронической наркомании [1], [2].

Критериями обоснованности злоупотреблений наркотическими средствами по международной классификации болезней (МКБ-10) являются: данные самоотчета (информация может быть получена при помощи беседы и (или) опросников), других информантов (семья, друзья, школа, милиция, психоневрологический и наркологический диспансеры), физическое обследование (истощение, узкие зрачки, следы инъекций и т.д.), объективный анализ (лабораторные данные, тестовые исследования и другие методы).

Выявление наркомании – комплексная система мер, начальным этапом которой являются скрининговые иммунохимические методы анализа (к ним относятся: иммуноферментный, флуороиммуноанализ, иммунохроматография и т.д.). Все перечисленные методы позволяют установить факт злоупотребления наркотиком только в течение первых 24-48 часов, что связано с быстрым выведением вещества из организма [3], [4], [5].

Цель исследования – оценить возможность использования для посмертной судебно-медицинской дифференциальной диагностики хронической наркомании метода выявления антител к ПАВ у лиц, умерших от различных заболеваний.

Для диагностики лиц, подозреваемых в употреблении наркотиков, использовали диагностику методом твердофазного иммуноферментного анализа определения наличия антител к производным метаболитов анализируемых наркотических веществ в сыворотке крови. Способ включает инкубацию анализируемой пробы с конъюгатом гаптен – макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердой фазе; инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека, меченных ферментом; выявление уровня специфических антител по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков, содержащихся в сыворотки крови и установление факта потребления последних в случае совпадения или превышения уровня антител в анализируемой и эталонной пробе. Особенность способа заключается в использовании конъюгата, в котором гаптен является производным метаболита анализируемого наркотического вещества, а макромолекулярный носитель выбран из ряда поли- или олигоакрилатов, овальбумина и лизоцима, при соотношении гаптен: макромолекулярный носитель (3-12):1 (мол. %) [6]. Метод позволяет по образованию специфичных маркеров-антител в сыворотке крови человека установить факт их приема в более отдаленные сроки после последнего попадания наркотика в организм, когда в других биологических жидкостях он уже отсутствует.

Исследование крови проводили с помощью наборов твердофазного иммуноферментного анализа «Дианарк» для установления факта употребления ПАВ путём определения содержания антител к амфетаминам, барбитуратам, кокаину, опиатам, эфедрону и каннабиноидам [7]. Минимальное содержание антител к содержанию ПАВ, присутствующих в образце, соответствует значению 0,35 усл. ед., что соответствует концентрации антител ̉~ 1,7 мкг/мл. Данные анализа ниже 0,35 усл. ед. расцениваются как отрицательные. Полученные при выполнении анализа результаты в диапазоне 0,35-0,40 усл. ед. свидетельствуют о начальном этапе появления антител к ПАВ в сыворотке крови человека, т.е. этот факт требует дальнейшего повторного тестирования и наблюдения изменений в динамике. Результаты анализа, соответствующие значениям более 0,40 усл. ед., свидетельствуют о положительной иммунной реакции, то есть о факте употребления наркотиков, в состав которых входят ПАВ данной группы [5].

Авторами [5], [6], [7] указано, что в редких случаях положительные результаты может давать сыворотка крови при наличии аутоиммунных и инфекционных заболеваний. Вместе с тем авторы приводят и другие причины как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов иммуноферментного анализа у живых лиц. Так, ложноположительные результаты могут обусловить недавно перенесенные операции и другие медицинские вмешательства с использованием анестезии, применение некоторых седативных препаратов, антидепрессантов и антибиотиков, аутоиммунные заболевания, недавно перенесенные тяжелые инфекции, недавно сделанные прививки, менструации и беременность. Ложноотрицательные результаты могут быть при состоянии иммунодефицита, наркотического опьянения либо в течение первых 2-х суток с момента приема ПАВ, так как в организме повышен уровень ПАВ и их метаболитов. Антитела к ПАВ выполняют свою компенсаторную функцию: они связываются с метаболитами ПАВ в иммунные комплексы, и таким образом уровень свободных антител в кровотоке падает [8].

В официальных источниках мы не нашли данных по выявлению антител к ПАВ в трупной крови данным методом. Ранее нами была изучена возможность выявления антител к опиатам, амфетаминам, кокаину, барбитуратам, эфедрону, каннабиноидам иммуноферментным методом на трупном биоматериале (кровь) в сроки до 24 час после наступления смерти и условии хранения трупной сыворотки при температуре – 18℃ до 14 суток при необходимости проведения отсроченного иммуноферментного исследования. Результаты исследования показали, что антитела к амфетаминам, барбитуратам, кокаину, каннабиноидам, опиатам, эфедрону выявляются в трупной крови (сыворотке) вне зависимости от наличия и степени гемолиза в сроки 24 ч после наступления смерти, их содержание стабильно в трупной крови (сыворотке) в условиях хранения при температуре -18оС в срок до 14 дней [8], [9], [10].

Вышеизложенное послужило основанием для проведения биохимического исследования трупной крови лиц злоупотребляющих ПАВ.

Исследовалась кровь от 210 трупов лиц в возрасте от 2 до 68 лет, из них трупов мужского пола – 169, женского – 41.

В качестве причины смерти фигурировали различные виды смерти: травма, острые и хронические эндогенные интоксикации, сердечно-сосудистые заболевания, гормон продуцирующие опухоли. Давность наступления смерти во всех случаях составляла до 24 час.

Определение качественного содержания антител к опиатам, амфетаминам, кокаину, барбитуратам, эфедрону, каннабиноидам в сыворотке трупной крови производили иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов реагентов для иммуноферментного определения антител отдельно к каждому классу наркотических веществ – к амфетаминам, барбитуратам, кокаину, каннабиноидам, опиатам, эфедрону.

Параллельно проводилось судебно-химические исследования инструментальными физико-химическими методами [11], [12], [13], [14].

Проведено 1260 исследований образцов трупной крови. Пробоподготовка предусматривала центрифугирование при 3000 оборотах в течение 10 мин, отбор супернатантов полуавтоматическими микродозаторами с использованием одноразовых наконечников в сухие чистые пластиковые пробирки объемом 20 мл с завинчивающейся крышкой.

Полученные результаты на психоактивные вещества были распределены на 3 группы для дальнейшего анализа:

- группа №1 – положительный результат судебно-химическими исследованиями и положительный результат иммуноферментными исследованиями;

- группа №2 - положительный результат судебно-химическими исследованиями и отрицательный результат иммуноферментными исследованиями;

- группа №3 - отрицательный результат судебно-химическими исследованиями и положительный результат иммуноферментными исследованиями.

Доля каждой группы в общем исследовании представлена в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что в группе 1 результат коррелировал с данными морфологического исследования и могло явиться причиной смерти в результате отравления психоактивными веществами, а в группе 2 полученные данные могут указывать на острое отравление.

Таким образом, в 74% случаев наличие или отсутствие антител к ПАВ было вполне логичным и не противоречило основному и сопутствующим диагнозам.

Наиболее противоречивыми были результаты группы 3, поэтому проанализировали прижизненные заболевания умерших людей. Данные представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что в 5-ти случаях смерть наступила в результате травмы, что теоретически не исключает возможность злоупотребления ПАВ, в 1-м случае диагнозом явилось состояние иммунодефицита (что противоречит авторским данным по живым лицам, где имеется указание, что состояние иммунодефицита может обусловить ложноотрицательный результат иммуноферментного анализа). В двух случаях положительные результаты, предположительно были вызваны возможным повышением содержания эндогенных эндорфинов. Первый случай – смерть беременной женщины 38-ми лет наступила от кардиомиопатии на фоне полиэндокринопатии при беременности 28-29 недель, осложнившихся сердечно-сосудистой недостаточностью, отеком головного мозга и развитием полиорганной недостаточности, антитела к опиатам составили 0,51 у.е., что подтверждает реакцию перекреста антител к опиатам и эндогенных эндорфинов, характерную для беременных и кормящих женщин. Второй случай – смерть ребенка 2-х лет наступила в результате падения с высоты, антитела к кокаину составили 0,56 у.е. Ребенок находился на грудном вскармливании, что может быть причиной возможного повышения содержания эндогенных эндорфинов в крови, давших ложноположительный результат.

На основании вышеизложенного при использовании метода твердофазного иммуноферментного анализа при посмертной диагностике хронической наркотической интоксикации следует учитывать наличие прижизненных заболеваний у исследуемого трупа. Это позволит избежать ложноположительных результатов при проведении судебно-медицинской экспертизы.

1. Предложен метод твердофазного иммуноферментного анализа для исследования трупного биологического материала для посмертной диагностики хронической наркотической интоксикации.

2. Данный метод адаптирован и апробирован на 210 случаях при исследовании биологических объектов трупа.

3. Установлено, что ложноположительные реакции, сопровождающиеся перекрестом антител к ПАВ, выявлены при эндокринопатиях – особенно при наличии гормон-продуцирующих опухолей.