MORPHOFUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF MICE HEPATOCYTES NUCLEI IN PLUMBUM INTOXICATION

Купша Е.И.

ORCID: 0000-0002-4572-6732, кандидат медицинских наук, доцент, ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», г. Симферополь.

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДЕР ГЕПАТОЦИТОВ МЫШЕЙ ПРИ СВИНЦОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

Аннотация

Приведены количественные и качественные характеристики ядер гепатоцитов мышей при 30- суточном ежедневном пероральном введении малых доз ацетата свинца. С использованием гисторадиоавтографии, электронной микроскопии и морфометрии определены параметры изменений в ядрах гепатоцитов. Установлено достоверное снижение количества двуядерных гепатоцитов, снижение площади эухроматина с одновременным повышением его функциональной активности в 3,5 раза, снижение площади ядрышек и их гранулярного компонента. Результаты исследований показали, что малые дозы свинца оказывают супрессивный эффект на белоксинтетический аппарат клетки.

Ключевые слова: свинец, тяжелые металлы, печень, гепатоциты, ядро.

Kupsha E.I.

ORCID: 0000-0002-4572-6732, MD, Associate professor, V.I. Vernadsky Crimean Federal University, Simferopol

MORPHOFUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF MICE HEPATOCYTES NUCLEI IN PLUMBUM INTOXICATION

Abstract

Quantitative and qualitative characteristics of the hepatocyte nuclei of mice case of 30-day daily oral administration of small doses of plumbum acetate are presented. The parameters of changes in the nuclei of hepatocytes have been determined with the use of histoautoradiography, electron microscopy and morphometry. A significant decrease in the number of binuclear hepatocytes was established, a decrease in the euchromatin area, with a simultaneous increase in its functional activity in 3.5 times, a decrease in the area of the nucleoli and their granular component. The results of the studies showed that small doses of plumbum have a suppressive effect on the protein-synthesizing apparatus of the cell.

Keywords: plumbum, heavy metals, liver, hepatocytes, nucleus.

Сообщается, что один из наиболее известных природных тяжелых металлов свинец вызывает повреждение печени и клеточный апоптоз нарушая баланс прооксидант-антиоксидантной системы инициируя окислительный стресс посредством усиления продукции активных форм кислорода и перикисного окисления липидов приводящие к разрушению мембран, повреждению ДНК, белков и углеводов [1, С. 29592],[2, С.1034], [8-3, С. 821524]. Установлено, что даже кратковременное введение малых доз свинца мышам, сравнимое с ежедневными дозами, поступающими в организм жителей геохимических провинций, вызывало печеночную дисфункцию и гибель гепатоцитов [3-4, С. E56894], [9-5, С. 107], [10-6, С. 656]. Учитывая растущую антропогенную нагрузку, широту распространения загрязнения свинцом, новые факты о генотоксичности ксенобиотика [4-7, С. 142],[6-8, С. 544], [7-9, С. 2905] и максимум его кумуляции в печени [5-10, С. 230], актуальность цели — определить морфофункциональные маркеры повреждения ядерного аппарата гепатоцитов является обоснованной.

Свинцовую интоксикацию моделировали на 6 самцах белых мышей линии Balb/c, которые получали перорально ацетат свинца в дозе 1 мг/100 г массы тела, в течение 30 суток. 5 животных служили контролем. Образцы ткани печени исследовались с применением световой и электронной микроскопии, гисторадиоавтографии, морфометрии. Для получения сопоставимых результатов с применением метода гисторадиоавтографии эксперимент завершали в одно и то же время суток – 12 часов дня. За 1 час до взятия материала животным внутримышечно вводили меченный предшественник ДНК-3Н-тимидин в дозе 6,5 мкКu/г. Метод применен с целью установления активности синтеза ДНК клетками паренхимы печени [Епифанова]. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм покрывали фотоэмульсией – М (разведение 1:3), экспозиция составляла 14 дней. После фиксации и проявки срезы окрашивали 1% спиртовым раствором толуидинового синего. Гисторадиоавтографическую метку (зерна серебра) подсчитывали под световым микроскопом (глицериновая иммерсия, увеличение 90х10х1,25). Морфометрия проведена с применением оптического анализатора изображения «OLIMPUS BH-2» с использованием лицензионного программного обеспечения «Видеотест – Морфология» и стандартного пакета статистических программ Excel с учетом числа срезов и количества животных (Г.Г.Автандилов, 1990). Использовали t-критерий Стьюдента. Статистически достоверными считали изменения при Р≤0,05.

Ядра гепатоцитов значительно варьируют по размеру, их диаметр колеблется в пределах 5,8–7,2 мкм (см. таблица 1). Процент двуядерных гепатоцитов снижен по сравнению с контрольными животными и составляет 5,15±0,82% для светлых гепатоцитов и 6,47±0,59% для темных гепатоцитов. Аналогичные показатели в группе контроля составляют 7,69±0,91% и 12,89±3,44%.

 

Таблица 1 – Морфометрические показатели ядер гепатоцитов при 30- суточной свинцовой интоксикации (Pb) в сравнении с контролем (К)

Параметры		К	Pb
Площадь профильного поля ядер, мкм2	М m %	62,07 7,22	38,65* 2,10 62,26
Максимальный диаметр ядер, мкм	М m %	10,3 0,74	7,27** 0,20 70,58
Минимальный диаметр ядер, мкм	М m %	6,27 0,15	5,85 0,16 93,3
Средний диаметр ядер, мкм	М m %	8,27 0,39	6,59*** 0,17 79,68
Периметр ядер, мкм	М m %	30,2 2,73	21,28** 0,57 70,46

Примечание: звездочками указаны достоверно значимые отклонения, где вероятность ошибки в сравнении с контролем: * - р < 0,05;  ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.

 

Наряду с гепатоцитами, подвергающимися некробиотическим и дистрофическим изменениям, в значительном количестве присутствуют клетки с ультраструктурными признаками достаточной или повышенной функциональной активности. Ядра таких гепатоцитов крупные, округлой формы, с неглубокими инвагинациями кариолеммы. В них преобладает эухроматин. Гетерохроматин представлен в умеренных количествах и распределяется по всей кариоплазме. Небольшое его количество равномерно и типично локализовано вдоль кариолеммы. Ядрышек 1-2, в некоторых клетках до 4-х. Ядрышки локализуются эксцентрично, имеют округлую форму и обычную электронную плотность. В мелких ядрышках лучше выражен гранулярный, а в крупных – фибриллярный компоненты. Ядерные поры увеличены и четко контурированы, в местах их локализации примембранный гетерохроматин отсутствует. Большая часть поровых комплексов электронноплотная.

Морфологический анализ показателей ядерной структуры и функции выявил следующее. Максимальный, минимальный и средний диаметры ядер гепатоцитов оказались несколько ниже контрольных значений, что позволяет говорить о свинецобусловленной дизадаптации в системе цитоплазматического синтеза структурных белков для кариоплазмы и нуклеоплазмы. Несмотря на наличие популяций гепатоцитов с функционально активным эухроматином, среднестатистические показатели свидетельствуют о снижении его процентного состава и увеличении доли транскрипционно неактивного гетерохроматина до 49,38±1,30% (в контроле – 40,10±0,87%), Р<0,05 (см. таблица 2). Наблюдалась интенсификация включения 3Н-тимидина в ядерную ДНК как в светлых, так и в темных гепатоцитах – 141,56±19,65‰ и 141,37±14,81‰, против контрольных значений 43,31±9,10‰ и 30,18±5,28‰, соответственно. При этом разница является статистически достоверной. Дизадаптивные изменения отмечены и в системе кариокинеза. Процент двуядерных гепатоцитов как светлых, так и темных, оказался ниже контрольных показателей практически наполовину. Для светлых клеток он составлял 5,15±0,82%, против контрольных цифр 7,69±0,91% (Р<0,05), а для темных – 6,47±0,50% и 12,89±3,44%, соответственно (Р<0,05). Средняя площадь ядрышка в данной серии эксперимента также практически наполовину была ниже контрольного значения.

 

Таблица 2 – Морфофункциональные показатели гепатоцитов при 30- суточной свинцовой интоксикации (Pb) в сравнении с контролем (К)

Параметры		К	Pb
Светлые гепатоциты ИМК (‰)	М m %	43,31 9,1	141,56** 19,65 326,85
Темные гепатоциты  ИМК (‰)	М m %	30,18 5,28	141,37*** 14,81 468,42
% двуядерных светлых гепатоцитов	М m %	7,69 0,91	5,15 0,82 66,97

Продолжение таблицы 2 – Морфофункциональные показатели гепатоцитов при 30- суточной свинцовой интоксикации (Pb) в сравнении с контролем (К)

Параметры		К	Pb
% двуядерных темных гепатоцитов	М m %	12,89 3,44	6,47 0,59 50,19
% гетерохроматина в ядре	М m %	40,10 0,87	49,38* 1,30 123,14
% площади ядрышка	М m %	7,44 0,16	3,91*** 0,03 52,55
% гранулярного компонента	М m %	82,01 0,95	79,74 1,60 97,23

 

Дистрофические изменения диагностируются также в основных субклеточных хранилищах генетической информации – ядрах гепатоцитов и проявляются в форме просветления кариоплазмы, дезорганизации ядерного хроматина, кариопикноза, появлении не типичных внутриядерных, в частности липидных, включений.

Таким образом, характерной компенсаторной и регенераторной реакции, призванной обеспечить восстановление количества функционирующих гепатоцитов по типу пролиферативного ответа, не наблюдается. На внутриклеточном уровне в группировках сохранившихся клеток паренхимы обращает на себя внимание высокая функциональная активность эухроматина, который в 3,5 раза активнее, чем в контроле, включает ³Н-тимидин. Ответная реакция ядерного генома, направленная на поддержание популяции полиплоидных гепатоцитов, визуализируемая на уровне бинуклеарности, отличается недостаточной интенсивностью: процент двуядерных светлых и темных гепатоцитов не достигает контрольных значений. Интенсивность процессов внутриядерной транскрипции, ультраструктурным маркером которой является ядрышко, остается на низком уровне – процент площади нуклеол составляет всего 3,91±0,03%. Компенсаторной репаративной гиперплазии, и, гипертрофии и дупликации ядрышек не наблюдалось, что свидетельствует об имеющейся супрессии в системе биосинтеза рРНК.

Список литературы / References

1. Tasleem A.J. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants / A.J. Tasleem, A. Mudsser and all.// Int. J.Mol.Sci. – 2015. – Vol. 16(12). – Р. 29592–29630. doi:10.3390/ijms161226183
2. Alya A. Oxidative stress, biochemical alterations, and hyperlipidemia in female rats induced by lead chronic toxicity during puberty and post puberty periods / A. Alya, D.B. Ines and all. // Iranian Journal of Basic Medical Sciences. – 2015. – Vol. 18(10). – Р.1034-1043.
3. Mohammadi M. Caloric Restriction Prevents Lead-Induced Oxidative Stress and Inflammation in Rat Liver / M. Mohammadi, R. Ghaznavi, R. Keyhanmanesh and all. // The Scientific World Journal. – 2014. – Vol. 2014. – P. 821524. doi:10.1155/2014/821524
4. Pal P.B. Mangiferin, a Natural Xanthone. Protects Murine Liver in Pb(II) Induced Hepatic Damage and Cell Death via MAP Kinase, NF-κB and Mitochondria Dependent Pathways / P.B. Pal, K. Sinha, P.C. Sil // PLoS ONE. – 2013. – Vol. 8(2). – P. e56894. doi:10.1371/journal.pone.0056894
5. Offor S.J. Lead Induced Hepato-renal Damage in Male Albino Rats and Effects of Activated Charcoal / S.J. Offor, H.O.C. Mbagwu, O.E. Orisakwe // Frontiers in Pharmacology. – 2017.– Vol.8.–P.107. doi:10.3389/fphar.2017.00107.
6. Long M. Proanthocyanidins Attenuation of Chronic Lead-Induced Liver Oxidative Damage in Kunming Mice via the Nrf2/ARE Pathway /M. Long, Y. Liu, Y. Cao Y. et all.// Nutrients. – 2016. – Vol. 8(10).–P. 656. doi:10.3390/nu8100656.
7. Senut M.C. Lead Exposure Disrupts Global DNA Methylation in Human Embryonic Stem Cells and Alters Their Neuronal Differentiation /M.C. Senut, A. Sen and all. // Toxicological Sciences. – 2014. – Vol. 139(1). – Р.142-161. doi:10.1093/toxsci/kfu028
8. Nye M.D. In vitro lead exposure changes DNA methylation and expression of IGF2 and PEG1/MEST / M.D. Nye, C. Hoyo, S.K. Murphy // Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. – 2015. – Vol. 29(3). – P. 544-550. doi:10.1016/j.tiv.2015.01.002
9. Yuan G. Sub-chronic lead and cadmium co-induce apoptosis protein expression in liver and kidney of rats / G. Yuan, S. Dai, Z. Yin et all. // International Journal of Clinical and Experimental Pathology. – 2014. – Vol. 7(6). – P. 2905-2914.
10. Winiarska-Mieczan A. The Effect of Exposure to Cd and Pb in the Form of a Drinking Water or Feed on the Accumulation and Distribution of These Metals in the Organs of Growing Wistar Rats/ A. Winiarska-Mieczan, M. Kwiecień // Biological Trace Element Research. – 2016. – Vol. 169. – Р. 230-236. doi:10.1007/s12011-015-0414-4