Histological evaluation of the toxicity of Phlojodicarpus sibiricus extract on liver and kidney of ICR line mice

В последние десятилетия все большее внимание ученых привлекают природные соединения, которые могут оказывать воздействие на иммунную систему. Это связано с необходимостью разработки новых средств для коррекции иммунного статуса, особенно в условиях возрастающей заболеваемости инфекционными и онкологическими заболеваниями, а также роста числа аллергических и аутоиммунных расстройств. Одним из перспективных направлений в этой области является изучение лекарственных растений и их экстрактов, обладающих иммуностимулирующими или иммуномодулирующими свойствами. Эксперименты на животных моделях показывают, что многие природные соединения могут вызывать как позитивные, так и негативные изменения в органах. Например, исследования на моделях гепатотоксичности демонстрируют, что высокие дозы некоторых фитопрепаратов могут приводить к структурным изменениям в печени, включая дистрофические процессы, некрозы гепатоцитов и воспалительные реакции в тканях. Эти изменения являются важными критериями для оценки потенциальной токсичности препарата и требуют тщательного анализа в экспериментальных исследованиях

Одним из таких растений является вздутоплодник сибирский (лат. Phlojodicarpus sibiricus), который принадлежит к семейству сельдерейных и распространен в северных регионах Сибири и Монголии

Биологически активные соединения растительных экстрактов могут оказывать влияние на клетки различных органов через активацию или подавление клеточных сигнальных путей. Флавоноиды и алкалоиды, присутствующие во Phlojodicarpus sibiricus, могут индуцировать изменения в тканях, такие как пролиферация клеток, воспалительные процессы и нарушение метаболизма, что приводит к дистрофическим изменениям и некрозам

Токсическое действие лекарственных растений, таких как экстракт Phlojodicarpus sibiricus, на органы может происходить через структурные изменения клеток и тканей в зависимости от дозировки и продолжительности воздействия. Биологически активные соединения, содержащиеся в экстракте, такие как флавоноиды и алкалоиды, могут оказывать как терапевтическое, так и токсическое воздействие на клетки печени и почек. В случае применения высоких доз экстракта возможно развитие цитотоксических эффектов, к которым относятся дистрофические изменения и некроз клеток

Механизмы токсичности экстракта Phlojodicarpus sibiricus перехода с его особенностью окислительный стресс и нарушать метаболизм клеток. Флавоноиды и алкалоиды, содержащиеся в экстракте, могут накапливаться в клетках печени и почек, приводя к их повреждению и дисфункции

В результате исследований на моделях животных установлено, что длительное введение высоких доз растительных экстрактов, таких как экстракт Phlojodicarpus sibiricus, может вызвать воспалительные процессы, дистрофию и некроз клеток и почек

Таким образом, изучение морфологических изменений в печени и почках под воздействием экстракта Phlojodicarpus sibiricus имеет большое значение для оценки его безопасности. Необходимо учитывать дозозависимый эффект экстракта, который проявляется в виде повреждения клеток и тканей при высоких дозировках и длительном применении. Это требует проведения исследований для определения оптимальных доз и оценок терапевтических препаратов

Цель исследования – на основе гистологического анализа печени и почек белых лабораторных мышей линии ICR оценить токсическое влияние экстракта Phlojodicarpus sibiricus при пероральном введении в зависимости от дозы и продолжительности его перорального введения.

Для выполнения подставленной цели нами было проведено экспериментальное исследование на белых лабораторных мышах линии ICR, которые наиболее чаще используются в качестве объектов исследования. Апробация экспериментальной работы и его протокол одобрен локальным этическим комитетом СВФУ (протокол № 32 от 8.12.2021г. решение № 6). Эксперимент был проведен на 25 самцах в возрасте от 4-5 недель с массой от 22 до 25 гр, которые были разделены на 5 групп сравнения (по 5 мышей в группе). При этом 1 группа – мыши, которым вводили перорально 10 мг/мл в течение 7 дней; 2 группа – мыши получавшие 100 мг/мл в течение 7 дней, 3 группа – мыши получавшие 10 мг/мл в течение 14 дней, 4 группа – мыши получавшие 100 мг/мл в течение 14 дней и контрольная группа – без введения экстракта.

Для экстрагирования использовали надземную часть (стебли, листья, цветки) Phlojodicarpus sibiricus, которую собирали в период цветения в Ботаническом саду ИБПК СО РАН. Высушивали в комнатных условиях без доступа света до воздушно-сухого состояния. Биологически активные вещества извлекали путем последовательного экстрагирования водно-этанольными 70% (трёхкратно) и 96% (двухкратно) растворами. Экстракты объединяли, упаривали на роторном испарителе до водной фракции, которую высушивали на лиофильной установке. Полученный сухой экстракт хранили в вакуумной упаковке в комнатных условиях без доступа света

Эксперимент проводился в условиях стандартного вивария, где мышам предоставлялись вода и корм в свободном доступе. Экстракт вздутоплодника сибирского вводился перорально один раз в день в 12 часов утра. По завершении экспериментальных сроков (7 и 14 день) мыши подвергались декапитации для последующего анализа тканей печени и почек. Морфологические изменения в тканях печени и почки осуществлялось гистопатологическим исследованием с использованием аппарата EG 1150 (Leica Microsystems, Германия). Ткани и органы помещали в 10% раствор нейтрального формалина, заключались в парафин на гистологической станции. На полуавтоматическом микротоме SM2010R (Leica Microsystems, Германия) изготавливали гистологические срезы толщиной 3-5 мкм. Образцы окрашивали гематоксилином и эозином на аппарате Autostainer XL (Leica Microsystems, Германия) по следующему протоколу: Парафин из срезов удаляется с помощью ксилола 2 раза по 10 и 5 мин соответственно. Затем обрабатывается 2 раза изопропиловым спиртом (батарея спиртов, нисходящих концентраций: 96% изопропанол – 10 мин, 70% изопропанол – 5 мин.) по истечении времени ополаскивается дистиллированной водой в течении 10 мин. Следующим шагом является окрашивание гематоксилином на 5 мин. Излишек красителя отмывается 10 мин. дистиллированной водой. 1% HCL происходит дифференцировка на 10 мин. затем промывается дистиллированной водой на 10 мин. С помощью 0,5% NH3 срезы промываются 10 мин. с последующей промывкой дистиллированной водой на 10 мин. Полученные срезы докрашиваются Эозином в течении 3 мин. потом срезы промываются дистиллированной водой на 10 мин. после ополаскивается 70% изопропиловым спиртом в течении 10 мин. Срезы просветляются готовой смесью карбола в течении 15 мин. Окончательное обезвоживание срезов производится ксилолом 2 раза по 10 и 5 мин. Готовые окрашенные срезы консервируются в среде – витрогель. После высыхания направлялись на микроскопические исследования на оптическом микроскопе BX-41 (Olympus, Япония). Изучалась архитектоника тканей печени и почек, а также наличие дистрофических изменений, некрозов и воспалительных реакций.

Анализ гистологических срезов почек (рис.1.). Визуализация препаратов тканей почек контрольных мышей (без введения экстракта Phlojodicarpus sibiricus) указывает на сохранность архитектоники почечной ткани с умеренной полнокровностью сосудов среднего и крупного калибра. Следует отметить, что в некоторых сосудах отмечались эритроцитарные стазы и сладжи, при этом структура клубочков характеризуется сохранностью и малокровностью. Эпителий канальцев не имеет значительных изменений, а в просветах канальцев присутствуют эозинофильные массы (рис.1 а). В целом, гистологическое исследование почек контрольной группы свидетельствует об отсутствии выраженных патологических изменений.

Анализ гистологических срезов почек второй группы, получавшие экстракт в дозе 10 мг/мл и 100 мг/мл (рис.1 б, в) в течение 7 дней указывает на такие же признаки, как и в контрольной группе, что свидетельствует об отсутствии токсического влияния экстракта на почки. В целом, не наблюдалось значительных отклонений от нормы. Архитектоника ткани была сохранена, сосуды имели умеренную полнокровность, а клубочки оставались малокровными. Это указывает на то, что краткосрочное (в течение 7 дней) воздействие экстракта в указанных дозировках (10 мг/мл и 100 мг/мл) не оказывает значительного негативного токсического влияния на почечную ткань.

Рисунок 1 - Микрофотография почки: 

а - контрольная группа; б - группа, получавшая экстракт на протяжении 7 дней в дозе 10 мг/мл; в - группа, получавшая экстракт на протяжении 7 дней в дозе 100 мг/мл; г - группа, получавшая экстракт на протяжении 14 дней в дозе 10 мг/мл; д - группа, получавшая экстракт на протяжении 14 дней в дозе 100 мг/мл

Примечание: окраска почки гематоксилин-эозином; увеличение ×10

DOI:10.60797/IRJ.2024.149.19.1

При пероральном введении экстракта в течение 14 дней, нами полученные результаты гистологических срезов почек указывают на аналогичные тем, которые были получены при введении экстракта в течение 7 дней. В группе, получавшей 10 мг/мл (рис.1 г), сохранялась архитектоника ткани, сосуды оставались полнокровными, клубочки малокровными, эпителий канальцев без значимых изменений. В группе, получавшей 100 мг/мл (рис.1 д), структура ткани также оставалась сохранной.

Таким образом, полученные результаты анализа гистологических срезов тканей почки мышей в зависимости от дозы и продолжительности перорального введения экстракта Phlojodicarpus sibiricus указывают на отсутствие токсичного воздействия.

Анализ гистологических срезов печени (рис.2.). В контрольной группе отмечается фрагменты ткани с сохранной гистоархитектоникой. Портальные тракты не расширены, наблюдается рассеянная лимфоидная инфильтрация. Следует отметить, что дольки печени балочного строения, с сохранными гепатоцитами с зернистой эозинофильной цитоплазмой, ядра с зернистым хроматином и отчетливыми ядрышками. Синусоиды при этом малокровны, часть центральных вен характеризуется полнокровностью (рис.2 а).

При введении экстракта в дозе 10 мг/мл на протяжении 7 дней (рис.2 б) в печени также наблюдалась сохранная архитектоника, без значительных отклонений от нормы. Лимфоидная инфильтрация в портальных трактах была минимальной, а дольки печени сохраняли нормальную структуру. Однако отмечаются единичные дистрофические изменения в виде вакуолизации цитоплазмы и ядра с зернистым хроматином. Синусоиды и центральные вены малокровны. В группе, получавшей экстракт в дозе 100 мг/мл на протяжении 7 дней (рис.2 в), отмечались более выраженные изменения: в ткани печени наблюдались некрозы гепатоцитов, пролиферация желчных протоков и вакуолизация цитоплазмы. Несмотря на эти изменения, в основном структура ткани оставалась сохранной, а патологические изменения не носили диффузного характера.

При длительном введении экстракта (14 дней) в дозе 10 мг/мл (рис.2 г) в печени продолжает наблюдаться сохранная архитектоника. Необходимо отметить, что пролиферация желчных протоков и некрозы гепатоцитов становятся более выраженными, особенно при высокой дозировке 100 мг/мл (рис.2 д.).

Рисунок 2 - Микрофотография печени: 

а - контрольная группа; б - группа, получавшая экстракт на протяжении 7 дней в дозе 10 мг/мл; в - группа, получавшая экстракт на протяжении 7 дней в дозе 100 мг/мл; г - группа, получавшая экстракт на протяжении 14 дней в дозе 10 мг/мл; д - группа, получавшая экстракт на протяжении 14 дней в дозе 100 мг/мл

Примечание: окраска печени гематоксилин-эозином; увеличение ×10

DOI:10.60797/IRJ.2024.149.19.2

Полученные нами результаты гистологического исследования печени выявили признаки токсического влияния экстракта в зависимости от дозы и продолжительности введения, патологические изменения наиболее выражены у мышей, получавших по 100 мг/мл в течение 14 дней.

Таким образом, результаты исследования показывают, что пероральное введение экстракта Phlojodicarpus sibiricus оказывает относительно мягкое воздействие на почки и печень мышей при краткосрочном введении в дозах 10 мг/мл и 100 мг/мл. Однако длительное воздействие и увеличение дозировки приводят к более выраженным изменениям в печени.

Таким образом, проведённое исследование показало, что экстракт Phlojodicarpus sibiricus оказывает значительное влияние на морфологическое состояние почек и печени белых лабораторных мышей линии ICR. Полученные данные свидетельствуют о том, что эффект экстракта является дозозависимым и варьируется в зависимости от продолжительности его применения. При краткосрочном введении экстракта даже в высоких дозах почки и печень сохраняли свою архитектуру с минимальными изменениями, что указывает на умеренное воздействие. Однако длительное введение экстракта, особенно в дозе 100 мг/мл, привело к более выраженным патологическим изменениям, особенно в ткани печени, где наблюдались дистрофические изменения и некрозы гепатоцитов.

Эти результаты подчеркивают потенциальную роль экстракта как биологически активного вещества с цитотоксическими свойствами при долгосрочном применении. Однако для полноценного понимания его механизмов действия и оценки безопасности необходимо проведение дальнейших исследований, включая клинические испытания и оценку возможных долгосрочных эффектов, связанных с накоплением активных компонентов в тканях организма.