USE OF PCR GENOTYPING ON A SAMPLE OF TURKEYS FROM THE CREATED MEDIUM CROSS

Research article
DOI:
https://doi.org/10.23670/IRJ.2023.137.151
Issue: № 11 (137), 2023
Submitted :
08.09.2023
Accepted:
08.11.2023
Published:
17.11.2023
572
8
XML
PDF

Abstract

Creation of a new medium cross of domestic breeding turkeys should be accompanied by a reliable scheme of prophylactic and anti-epizootic measures, which are based on the use of modern molecular genetic methods. The studies were carried out using PCR-genotyping of bacterial isolates extracted from turkeys during the creation of a new medium cross. Sampling was performed from adult fallen birds at the production base of SSC "SKZOSP" in 2023 to identify microorganisms of bacterial nature, with subsequent study of spectra by RAPD-PCR-genotyping with primers ERIC and M13. The analysis of the obtained genetic profiles showed a significant genetic diversity of bacterial isolates. The data obtained using the two RAPD primers were in agreement with each other.

1. Введение

Циркулирование возбудителей бактериальных инфекций во внешней среде приводит к периодическим вспышкам заболеваний

,
,
. Такое заболевание как колибактериоз, несёт особую угрозу, так как в промышленных условиях индейки находятся при определённой плотности посадки. Биологические особенности современных промышленных кроссов предрасполагают к острому течению многих инфекционных заболеваний, снижению рентабельности производства.

В настоящее время постоянно обнаруживаются резистентные бактерии к новейшим препаратам. Проблема антибиотикорезистентности микроорганизмов наиболее актуальна в отрасли птицеводства, в нашем случае для индейководства. Снижение актуальности этой проблемы достигается как контролируемым применением антибиотиков, так и использованием генотипирования в профилактических целях

,
. Разработка системы контроля бактериальных болезней индеек в промышленных условиях с использованием быстрой диагностической процедуры на основе RAPD-PCR и других методов генотипирования является одним из путей решения
,
,
. Тестирование микроорганизмов на чувствительность к антибиотикам как традиционным методом индикаторных дисков, так и с использованием ПЦР-генотипирования позволяет определить антибиотикорезистентность по генетической природе микроорганизмов для последующей корректировки схемы ветеринарно-санитарных мероприятий
,
, в том числе и в индейководстве.

Цель исследований: целью научно-исследовательской работы являлось определение антибиотикорезистентности патогенной и условно-патогенной микрофлоры, выделяемой у индеек создаваемого среднего кросса СГЦ «СКЗОСП» для составления схем ветпрофилактики и биозащиты, подбор условий для выявления методом RAPD-PCR генетических вариантов патогенных штаммов E. coli – актуального патогена птиц промышленных пород. 

2. Методы и принципы исследования

Исследования были проведены на производственной базе СГЦ «СКЗОСП» – филиала ФНЦ «ВНИТИП». В соответствии с государственным заданием в СГЦ проводится работа по созданию нового среднего кросса индеек. После завершения всех регистрационных процедур кросс получит свое официальное название. Совместно с исполнителями темы от ВНИВИП – филиала ФНЦ «ВНИТИП» было проведено клиническое обследование всего поголовья индеек, проанализированы меры биобезопасности, исследована действующая схема профилактических и противоэпизоотических мероприятий, проведено вскрытие павшей индейки, отобран патологический материал для дальнейшего бактериологического и ПЦР-анализа. Бактерии выделяли также из 20 клинически здоровых индеек для молекулярно-генетического исследования. Данные работы проводились в лаборатории молекулярной генетики ВНИИГРЖ (лаборатория имеет статус «Лаборатория молекулярно-генетической экспертизы», который был выдан в соответствии с приказом № 605 МСХ РФ 29 декабря 2018 г. со сроком действия на 5 лет). Биопробы из внутренних органов индеек помещены в транспортную среду Кэри-Блэйра. После транспортировки все пробы пересеяны на питательную среду для культивирования аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов: мясопептонный бульон для дальнейшего термостатированния при 37оС. Через 24 часа сделаны пересевы на дифференциально-диагностические среды – XLD-агар, агар Эндо, энтерококк агар, желточно-солевой агар, мясопептонный агар. Выделенные на дифференциально-диагностических средах культуры в дальнейшем исследованы на определение чувствительности к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом на среде Мюллера-Хинтона. В результате бактериологического исследования проб внутренних органов и проб смывов с клоаки были выделены 22 культуры E.coli, которые служили объектом для ПЦР-генотипирования. Из них 20 изолятов представляли собой культуры, выращенные из мазков клоаки индеек. Помимо этих изолятов в анализ были включены также бактериальные культуры, полученные от павшей индейки под номерами 21 и 22.

Объектом исследования по генотипированию методом RAPD-PCR являлись изоляты бактерий Escherichia coli, выделенные из органов павшей индейки, а также из здоровых особей. Механизм детекции различий методом ПЦР заключается в разных местах связывания праймеров у разных видов и штаммов, что приводит к амплификации фрагментов ДНК разной длины.

Условия ПЦР для праймеров ERIC и М13: 95оС – 3 минуты, потом 45 циклов: 95оС – 15 секунд, 37оС – 15 секунд, 72оС – 60 секунд, в конце 72оС – 3 минуты. После завершения ПЦР образцы переносятся в лунки 1,5% агарозного геля и проводится электрофорез в течении 3-х часов при напряжении 100 вольт (примерно 5В/см). В гель предварительно вносится бромид этидия для визуализации свечения полос ДНК. В качестве маркера длин фрагментов ДНК использован GeneRuler (Thermo Fischer™) и ДНК фага λ, обработанная рестриктазой HindIII. Визуализация результатов проводилась с помощью окраски ДНК бромидом этидия на стадии перенесения в лунки геля и гель-документации под УФ-светом в трансиллюминаторе ECX-F20.M Vilber Lourmat.

3. Основные результаты

В 2023 году проведено выделение на дифференциально-диагностических средах культур, которые в дальнейшем подвергались культурально-биохимическим исследованиям и определению чувствительности к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом на среде Мюллера-Хинтона (Табл. 1).

Таблица 1 - Определение чувствительности выделенных культур микроорганизмов, к антимикробным препаратам диско-диффузионным методом

Культура микроорганизмов

Место выделения

Чувствительна

Погранична

Устойчива

Escherichia coli

Селезенка, почка

Флорфеникол, энрофлоксацин, ципрофлоксацин, меропенем, левофлоксацин

Доксициклин, фосфомицин, пефлоксацин, амоксициллин-клавулановая кислота

Амоксициллин, Ко-тримоксазол, тетрациклин, налидиксовая кислота, азитромицин

Enterococcus faecalis

Почка, легкое

Ванкомицин, амоксициллин

-

Доксициклин, левофлоксацин, ципрофлоксацин, тетрациклин,

Staphylococcus xylosus

Легкое

левофлоксацин

-

Тетрациклин, азитромицин, ванкомицин, доксициклин, ципрофлоксацин, амоксициллин

Proteus mirabilis

Печень, сердце, почка, селезенка, легкое, красный костный мозг

Флорфеникол, энрофлоксацин, амоксициллин, Ко-тримоксазол, меропенем, фосфомицин, амоксициллин+ клавулановая кислота, левофлоксацин

Ципрофлоксацин

Доксициклин, тетрациклин, налидиксовая кислота, пефлоксацин, азитромицин

В результате бактериологического исследования проб внутренних органов и проб смывов с клоаки были выделены 22 культуры E.coli, которые служили объектом ПЦР-генотипирования. Из них 20 изолятов представляли собой культуры, выращенные из мазков клоаки индеек. Помимо этих изолятов в анализ были включены также бактериальные культуры, полученные от павшей индейки под номерами 21 и 22.

В результате проведения ПЦР-генотипирования c использованием праймеров ERIC получены генетические профили изучаемых бактерий (Рис. 1) с формированием трех групп. К первой группе относятся изоляты под номерами 9, 10 и 11, второй 7 и 16, третьей 2, 4, 5 и 17. У отдельных изолятов праймеры ERIC не привели к четкой амплификации ДНК: 1, 4, 8, 13. Изоляты 21 и 22 были выделены из почки и селезенки павшей особи, видно, что между генетическими профилями есть различия. Данное наблюдение свидетельствует о возможности циркулирования разных штаммов в одной особи (в разных органах). В связи с тем, что праймеры ERIC выявляют малое число фрагментов ДНК в геномах E.coli, не удивительно, что у некоторых штаммов амплификат отсутствовал. Для достижения большей дискриминационной способности необходимо проведение генотипирования с большим числом праймеров и комбинирования этих результатов.

Результаты генотипирования 22 изолятов E.coli методом ПЦР с парой праймеров ERIC: 1-17 – смыв из клоаки индеек (выделение изолятов 07.04.23); 18-20 – смыв из клоаки индеек (выделение изолятов 21.04.23); 21 – изолят из почки павшей индейки (выделение изолята 07.04.23); 22 – изолят из селезенки павшей индейки (выделение изолята 07.04.23)

Рисунок 1 - Результаты генотипирования 22 изолятов E.coli методом ПЦР с парой праймеров ERIC:

1-17 – смыв из клоаки индеек (выделение изолятов 07.04.23); 18-20 – смыв из клоаки индеек (выделение изолятов 21.04.23); 21 – изолят из почки павшей индейки (выделение изолята 07.04.23); 22 – изолят из селезенки павшей индейки (выделение изолята 07.04.23)

Далее было проведено генотипирование этих же изолятов с помощью универсального праймера М13. Результаты генотипирования свидетельствуют о высоком генетическом разнообразии в изучаемой группе изолятов. Бактерии выращивались из мазков клоаки, т.е. имели эндогенную природу, что, возможно, объясняет их разнообразие. Тем не менее в отдельных случаях генетические профили совпадали, что говорит о существовании идентичных штаммов в кишечнике разных особей.
Результат генотипирования 21 изолятов E. coli с универсальным праймером М13: 1-19 – смывы из клоак здоровых индеек; дорожка 20 – изолят из почки павшей индейки; дорожка 21 – изолят из селезёнки заболевшей индейки

Рисунок 2 - Результат генотипирования 21 изолятов E. coli с универсальным праймером М13: 

1-19 – смывы из клоак здоровых индеек; дорожка 20 – изолят из почки павшей индейки; дорожка 21 – изолят из селезёнки заболевшей индейки

Анализ генетических профилей показал хорошую воспроизводимость результатов, полученных с праймерами ERIC и M13. Таким образом, в случае недостаточной дискриминации штаммов при ПЦР-генотипировании с праймерами ERIC дополнительно можно провести амплификацию с праймером М13.

4. Заключение

В 2023 году в СГЦ «СКЗОСП» – филиале ФНЦ «ВНИТИП» были продолжены исследования бактериальных изолятов от индеек создаваемого среднего кросса. Научная новизна работы заключается в валидации RAPD-PCR-метода генотипирования с применением праймеров ERIC и М13 на изолятах, полученных от индеек. Показано существенное генетическое разнообразие изолятов данной бактерии и хорошая воспроизводимость результатов при генотипировании с разными праймерами (ERIC и M13). Данный метод по генотипированию изолятов E. coli является одним из самых быстрых и не дорогих подходов к идентификации бактериальных штаммов. Результатом исследования используются при составлении схем ветеринарно-профилактических и противоэпизоотических мероприятий для поголовья индеек.

Article metrics

Views:572
Downloads:8
Views
Total:
Views:572