POLYMORPHISM OF TOLL-LIKE RECEPTORS – TLR4 (Asp299Gly) and TLR6 (Ser249Pro) IN PATIENTS WITH LUNG TUBERCULOSIS
POLYMORPHISM OF TOLL-LIKE RECEPTORS – TLR4 (Asp299Gly) and TLR6 (Ser249Pro) IN PATIENTS WITH LUNG TUBERCULOSIS
Abstract
This article studies the influence of polymorphism of TLR4 (Asp299Gly) and TLR6 (Ser249Pro) genes on the course of tuberculosis process in the lungs. Patient group – 120 patients of both sexes, population control – 30 people. Material – DNA isolated from leukocytes of peripheral venous blood using the reagent "DNA-express-blood" (LLC NTP "Litech", Moscow). In the present study, in the majority of patients with tuberculosis, we revealed the carriage of Toll-like receptor polymorphisms associated with the development of the disease in the "high-producing" allele of the Asp/Asp genotype of the TLR 4 gene (Asp299Gly), Ser/Ser of TLR 6 gene (Ser249Pro) and heterozygous Asp/Gly of TLR 4 gene (Asp299Gly), as well as mutant polymorphism Pro/Pro of TLR 6 gene (Ser249Pro).
1. Введение
Туберкулез (ТБ) – относится к категории особо опасных инфекционных заболеваний и уносит ежедневно жизни более 4500 тысяч человек по всему земному шару. Наиболее подвержены заражению лица, испытывающие социально-экономические трудности, работающие и проживающие в условиях высокого риска инфицирования, малоимущие и обездоленные граждане. На территории Российской Федерации в последние несколько лет отмечается тенденция к снижению уровня заболеваемости, распространенности, смертности и инвалидизации населения от туберкулеза . Кроме того, туберкулез, в большинстве случаев, развивается на фоне сниженного иммунологического ответа организма, и, при отсутствии адекватной химиотерапии, приводит к утяжелению и хронизации воспалительного процесса, что усугубляет дальнейшее снижение местного и системного иммунитета .
Врожденный иммунитет является первой линией защиты восприимчивого организма от инфекционных агентов . Распознавание патогенов происходит через многочисленные рецепторные структуры. Особую группу рецепторов составляют «паттерн – распознающие рецепторы» (PRRs) (от анг. Pattern – recognition receptor) .
Одним из наиболее значимых представителей семейства PRRs считаются Toll – подобные рецепторы, функции и экспрессия которых очень широко изучается как в норме, так и в патологии .
Толл – подобные рецепторы (англ. Toll – like receptor, TLR) – класс клеточных рецепторов с одним трансмембранным компонентом, который распознает составные части бактерий и активирует клеточный иммунитет, в итоге эти рецепторы выполняют главную роль в первичном иммунном ответе .
В настоящее время идентифицированы 13 представителей семейства TLR, среди которых TLR 1-9 – выявляются у мышей и человека, TLR 10 - только у человека, TLR 11, 12, 13, только у мышей , . В качестве факторов транскипции выступают консервативные структуры многих патогенов, липотейхоевые и маннуроновые кислоты, липополисахарид (LPS), липопротеиды, пептидогликаны, флагеллин и др. . Под действием эндогенных лигандов наблюдается гиперактивация TLRs, что может приводить к развитию чрезмерного воспалительного ответа, сопровождающегося повреждением тканей, что может рассматриваться как один из основных звеньев иммунопатогенеза многих патологий .
Учитывая вышесказанное, в настоящее время нам кажутся перспективными исследования о функционировании системы Toll – подобных рецепторов, а так же влияние полиморфизмов генов человека на этиопатогенез туберкулеза.
2. Методы и принципы исследования
Цель исследования: изучить влияние полиморфизма генов TLR4 (Asp299Gly) и TLR6 (Ser249Pro) на течение туберкулезного процесса в легких. В работе приведены данные результатов комплексного изучения 120 пациентов с установленным диагнозом «Туберкулез органов дыхания» состоящих на учете у фтизиатра в период 2014-2015 гг.
Критериями включения явились наличие подтвержденного диагноза туберкулеза органов дыхания. Критериями исключения послужили: больные с неустановленным диагнозом туберкулеза, с тяжелой коморбидной патологией (сахарный диабет обоих типов, опухоли легких).
Контрольную группу составили 30 исследуемых в возрасте 38,5+3,5 лет никогда не болевших туберкулезом и не состоящих на учете в фтизиопульмонологическом центре. Все исследуемые – жители Забайкалья, сопоставимы по возрасту и полу.
Всеми участниками подписано информированное согласие на включение в исследование № 69/2014 от 24 декабря 2014 года, которое было одобрено на заседании этического комитета ФГБОУ ВО «Читинская государственная медицинская академия».
Молекулярно-генетическое исследование проведено в НИИ Молекулярной медицины ЧГМА. В качестве биологического материала для исследования полиморфных маркеров использовали цельную кровь. Определение полиморфизма генов TLR4 Asp299Gly (rs4986790, A896G), TLR6 Ser249Pro (rs5743794, C745T) осуществлялось методом ПЦР с использованием праймеров ООО «Литех» (г. Москва). Анализу подвергалась геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов цельной крови c помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь», затем проводилась реакция амплификации с двумя парами аллель-специфичных праймеров.
Этап: цельная кровь с ЭДТА (антикоагулянт ЭДТА K3 / ЭДТА K2) центрифугировалась, после удалялась плазма, форменные элементы замораживались при -20°С. Затем содержимое пробирки размораживалось при комнатной температуре, и добавлялся реактив «ДНК-экспресс-кровь» равный по объему количеству форменных элементов в пробирке. Содержимое пробирки тщательно перемешивалось в течение 10 сек, и пробирка устанавливалась в предварительно прогретый до 98°С термостат на 10 мин. Затем центрифугировалась со скоростью 8000-12000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант использовали в качестве образца ДНК.
1 этап: Из компонентов комплекта готовили рабочие смеси с реакционной смесью норма и патология. После приготовления смеси разносили по 20 мкл в соответствующие пробирки и добавляли по 5 мкл супернатанта. Содержимое пробирок центрифугировали со скоростью 15003000 об/мин 3-5 сек и устанавливали в подогретый до +94°С программируемый термостат.
2 этап: Разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза.
3 этап: Разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза.
4 этап: Анализ результатов. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся полос (рис. 1).
Результаты анализа позволили дать три типа заключений: нормальная гомозигота, гетерозигота, мутантная гомозигота.
Распределение генотипов по исследуемым полиморфным локусам сравнивали на соответствие равновесию Харди - Вайнберга. Сравнение частот распределения генотипов в группах исследования проводили с помощью критерия χ2 (Пирсона) с поправкой Йейтса на непрерывность с использованием 4-польной таблицы сопряженности; если ожидаемых явлений в одной из ячеек было меньше 5, применяли точный критерий Фишера. Для оценки ассоциации изучаемых полиморфных вариантов генов с риском развития туберкулеза рассчитывали отношение шансов (Odds Ratio – OR) с доверительным интервалом 95%, причем OR=1 трактовали как «отсутствие ассоциаций»; OR>1 – как «положительную ассоциацию», OR<1 – как «отрицательную ассоциацию» генотипа с туберкулезом. Математическую обработку полученных результатов проводили методами непараметрической статистики на персональном компьютере при помощи Statistica 10 и с использованием online-калькулятора (http://gen-exp.ru/calculatoror.php).
3. Основные результаты
Рисунок 1 - Электрофореграммы продуктов амплификации (позитив и негатив):
1 - нормальная гомозигота; 2 - гетерозигота; 3 - мутантная гомозигота
Таблица 1 - Частота распределения генотипов гена TLR 4 (Asp299Gly) у больных туберкулезом органов дыхания и группе контроля
Полиморфизм генов | Больные туберкулезом n = 120 | Здоровые доноры n = 30 | х2 | р | OR1 | CI 95% | ||
Абс. | % | Абс. | % | |||||
Asp/Asp | 91* | 75,8* | 29 | 96,7 | 6,510 | 0,009 | 0,108 | 0,014-0,830 |
Asp/Gly | 26* | 21,7* | 1 | 3,3 | 5,273 | 0,009 | 9,242 | 1,205-70,851 |
Gly/Gly | 3 | 2,50 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Примечание: * - уровень значимости по сравнению с группой здоровых доноров (р<0,05)
Ген TLR4(CD284) расположен на хромосоме 9q32-33, экспрессируется как внутриклеточно, так и экстрацеллюлярно, запускает иммунный ответ по MyD88-независимому пути. Полиморфный маркер Asp299Gly гена TLR4представляет собой однонуклеотидную замену А → G в положении +896 в экзоне 3, приводящую к аминокислотной замене аспарагиновой кислоты на глицин в положении 299 полипептидной цепи во внеклеточном домене рецептора. Выявлено, что полиморфизм Asp299Gly гена TLR4 тесно связан с развитием гематогенного остеомиелита и системного кандидоза, бактериальных инфекций, передающихся половым путем, респираторно-синцитиальной инфекции у детей младшего возраста и новорожденных, 26 сепсиса, вызванного грамм-отрицательными бактериями, атопической патологии . Vidyant S. etal. (2018) показали, что полиморфизм гена TLR4 (Asp299Gly) является фактором риска восприимчивости к ВИЧ-1, тогда как между полиморфизмом Thr399Ile и ВИЧ-инфекцией не обнаружено никакой связи .
При анализе распределения частоты генотипов полиморфизма гена TLR 6 (Ser249Pro) у пациентов с туберкулезом выявлено снижение количества гетерозиготного генотипа Ser/Pro (в 4,2 раза) и увеличение числа носителей гомозиготного генотипа Ser/Ser (в 21,7 раза) по сравнению с таковыми в контрольной группе.
Гомозиготный вариант генотипа по мутантному полиморфизму Pro/Pro гена TLR 6 обнаруживался у 15 больных туберкулезом (12,5% исследуемых) соответственно (табл. 2).
Таблица 2 - Частота распределения генотипов гена TLR6 (Ser249Pro) у больных туберкулезом органов дыхания и группе контроля
Полиморфизм генов | Больные туберкулезом n = 120 | Здоровые доноры n = 30 | х2 | р | OR1 | CI 95% | ||
Абс | % | Абс | % | |||||
Ser/Ser | 62* | 51,7* | 9 | 30,0 | 4,520 | 0,041 | 2,494 | 1,056-5,889 |
Ser/Pro | 43 | 35,8 | 12 | 40,0 | 0,179 | 0,677 | 0,730 | 0,369-1,902 |
Pro/Pro | 15* | 12,5* | 9 | 30 | 5,469 | 0,026 | 0,333 | 0,129-0,862 |
Примечание: * - уровень значимости по сравнению с группой здоровых доноров (р<0,05)
Полученные данные согласуются с расчетами отношения шансов, которое свидетельствует в пользу того, что носительство гетерозиготного варианта Asp/Gly гена TLR 4 (Asp299Gly) (OR=9,942 [95% CI: 1,205 – 70,851]) и гомозиготного генотипа Ser/Ser полиморфизма гена TLR 6 (Ser249Pro)(OR=2,494 [95% CI: 1,056 – 5,889]) могут быть ассоциированы с развитием туберкулеза органов дыхания и рассматриваются как факторы риска развития заболевания (табл. 1).
Ген TLR6(CD286) локализован в хромосоме 4р13, по данным исследователей из Кореи с ишемическим инсультом ассоциированы некоторые SNP в гене TLR6 (Ser249Pro) в корейской нации, так же предполагают, что они влияют на тяжесть инсульта .
По результатам расчета критериев Крамера (V) и критерия Чупрова (K) выявлено, что наличие у жителей Забайкальского края гомозиготного генотипа Asp/Asp гена TLR 4 (Asp299Gly)(φ=0,2), полиморфизма Ser/Ser гена TLR 6 (Ser249Pro) (φ=0,1) и гетерозиготного Asp/Gly гена TLR 4 (Asp299Gly) (φ=0,3) и мутантного полиморфизма Pro/Pro гена TLR6 (Ser249Pro)связано с риском развития туберкулеза, так как является фактором предрасположенности к болезни (табл. 3).
Таблица 3 - Критерии оценки силы связи между фактором риска и исходом
Полиморфизм генов генотипы | Наименование критерия Критерий φ Критерий V Крамера* Критерий К Чупрова** | Сила связи |
TLR4 (Asp299Gly) | ||
Asp/Asp | 0,208 | Средняя |
Asp/Gly | 0,208 | Средняя |
TLR 6 (Ser249Pro) | ||
Ser/Ser | 0,174 | Слабая |
Ser/Pro | 0,035 | Несущественная |
Pro/Pro | 0,191 | Слабая |
Примечание: * - интерпретация полученных значений статистических критериев согласно рекомендациям Rea&Parker; ** - для четырехпольной таблицы, используемой в данном калькуляторе, все три критерия (φ, Крамера, Чупрова) принимают одно и то же значение
4. Заключение
В настоящем исследовании у большинства пациентов с туберкулезом нами выявлено носительство ассоциированных с развитием заболевания полиморфизмов генов Toll-подобных рецепторов по «высокопродуцирующему» аллелю генотипа Asp/Asp гена TLR 4 (Asp299Gly), Ser/Ser гена TLR 6 (Ser249Pro) и гетерозиготного Asp/Gly гена TLR 4 (Asp299Gly), а так же мутантного полиморфизма Pro/Pro гена TLR 6 (Ser249Pro).
Результаты исследования показывают, что индивидуальное носительство различных вариантов полиморфизмов генов TLR оказывает влияние на характер течения патологического процесса в легочной ткани, что в будущем, вероятно, позволит прогнозировать тяжесть течения и исход заболевания.