TECHNOLOGICAL APPROACHES TO THE USE OF IN VITRO METHODS FOR THE MASS PRODUCTION OF STONE FRUIT PLANTS

Корнацкий С.А.

ORCID: 0000-0002-1721-4529, Доцент, Кандидат сельскохозяйственных наук, Российский университет дружбы народов, Москва

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ МЕТОДА IN VITRO ДЛЯ МАССОВОГО ПРОИЗВОДСТВА РАСТЕНИЙ КОСТОЧКОВЫХ КУЛЬТУР

Аннотация

В статье обсуждается технологическая пригодность метода клонального микроразмножения для массового производства посадочного материала косточковых пород. Рассматривается прием повышения качества микрочеренков на этапе элонгации с использованием колб объемом 250 мл, укупоренных воздухопроницаемыми покрытиями из ватно-марлевых дисков. Для адаптации и доращивания микрорастений предлагается циклическая схема управлением ростовыми процессами, включающая моделирование до 3 периодов покоя и до 3 периодов роста в искусственных условиях в течение календарного года.

Ключевые слова: клональное микроразмножение, элонгация, микрочеренок, адаптация, микрорастение.

Kornatskiy S.A. 

ORCID: 0000-0002-1721-4529, Associate Professor, PhD in Agriculture, Russian Peoples' Friendship University, Moscow

TECHNOLOGICAL APPROACHES TO THE USE OF IN VITRO METHODS FOR THE MASS PRODUCTION OF STONE FRUIT PLANTS

Abstract

The article discusses the technological suitability of the method of clonal micropropagation for mass production of planting material stone rocks. Consider improving the quality of reception micrograftings step elongation using a 250 ml flask, sealed with breathable coating of cotton-gauze discs. To adapt and rearing microplants proposed scheme cyclic control growth processes, including modeling up 3 rest periods and up to 3 periods of growth in artificial conditions in a calendar year.

Keywords: clonal micropropagation, elongation, micrografting, adaptation, microplants.

Метод in vitro давно и обоснованно позиционируется в научном мире как наиболее эффективный способ вегетативного размножения растений. Однако практическая значимость его в сфере производства посадочного материала, а, именно, плодовых культур, не столь очевидна, хотя элементы метода достаточно основательно отрабатывались, как отечественными, так и зарубежными учеными, применительно к таким породам как слива, вишня, черешня [1]. Несмотря на успешность начальных этапов, существует проблема низкой воспроизводимости результатов исследований при переходе к массовому производству на этапах укоренения микрочеренков, адаптации микрорастений. Очень часто в научной литературе недостаточно освещены вопросы последующего доращивания микрорастений, которые при адаптации достигая высоты 2-5 см, останавливаются в росте, после чего требуется весьма длительный период для возобновления ростовых процессов. Основной предлагаемый выход из ситуации - их зимовка в естественных условиях, что затягивает период доращивания растений, как минимум, до 2 лет.

 Поэтому новые подходы к решению данной проблемы весьма актуальны, прежде всего, в плане большей управляемости и лучшей предсказуемости конечного результата.

В наших исследованиях целью ставилось общее повышение технологичности микроразмножения косточковых культур на основе модернизации этапов элонгации микропобегов, укоренения микрочеренков, адаптации и доращивания микрорастений.

Исследования по клональному микроразмножению косточковых пород проводили в биотехнологической лаборатории аграрно-технологического института Российского университета дружбы народов с 2012 года. В качестве объектов исследований использовали сорт черешни Фатеж и сорт вишни Память Еникеева, выведенные во Всероссийском селекционно-технологическом института садоводства и питомниководства (ВСТИСП)  и районированные в Нечерноземной полосе России. На начальных стадиях исследований, преимущественно, руководствовались общепринятой методикой.    Исходные экспланты, конгломераты почек и побегов побеги культивировали на питательной среде Murashige и Skoog (1962). Пролиферацию культур проводили в пробирках при концентрации 6-бензиламинопурина (6-БАП) 1,0 мг/л, элонгацию осуществляли на фоне низких концентраций 6-БАП (0,05-0,1 мг/л). В качестве культивационных сосудов, при этом, использовали колбы объемом 250 мл с 80-90 мл питательной среды, которые после посадки материала накрывали ватно-марлевыми (косметическими) дисками для обеспечения нормального воздушно-газового обмена. На этапе ризогенеза изучали β-3-индолилмасляную кислоту (ИМК) и β-индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрациях 0,5-1,0 мг/л.  Для изучения особенностей корнеобразования микрочеренки подразделяли на ростовые группы – 1) 2-3 см и 2) 4-5 см.  Культивационные сосуды (колбы, пробирки) содержали в течение пассажей в культуральной комнате с контролируемыми параметрами - интенсивность освещения 5,0–5,5 клк, 16 часовой фотопериод и температура 24±1ºС.

Микрорастения черешни и вишни высаживали на адаптацию в теплицу в начале мая, а после остановки роста в середине июня (через 1,5 мес.) перемещали в холодильную камеру с температурой +5…+7⁰С для прохождения периода покоя на срок 2,5 мес. Следующий (2-й) цикл вегетации обеспечивался с начала сентября до середины октября. После покоя длительностью 2,5 мес., 3-й цикл роста с использованием досвечивания интенсивностью 5-6 клк проводили в период 1 января - 15 февраля. Третий период покоя также длительностью 2,5 мес. предшествовал высадке растений в конце апреля в открытый грунт.

Собственно микроразмножение стерильных культур при соблюдении регламентов проходило без каких-либо очевидных особенностей, с коэффициентом размножения за пассаж 1:4-7. В течение месяца в пробирках формировались объемные конгломераты, которые высаживали на элонгацию.

Реализация нового варианта укупорки культивационных сосудов позволила существенно повысить эффективность этапа элонгации растительного материала in vitro. Ватно-марлевые диски, изготавливаемые промышленно, оказались удачной альтернативой ватно-марлевым пробкам, которые имеют в последнее время ограниченную применимость из-за достаточно трудоемкой процедуры изготовления, низкой технологичности использования и проблем с хранением ввиду их громоздкости, особенно в большом количестве.

Безусловно, наиболее удобны для укупорки культивационных сосудов полимерные полиэтиленовые, поливинилхлоридные и т.п. пленки, используемые однократно, однако они, даже при толщине 7 – 9 мкм, имеют очень серьезный недостаток – исключают или существенно ограничивают газообмен внутреннего объема культивационного сосуда с окружающей средой. В результате этого, совершенно очевидно, что внутренний объем насыщается газообразными продуктами жизнедеятельности растущего материала. Но что самое негативное, под пленкой скапливается этилен - мономер химически синтезированных пленок. Регуляторные свойства этилена известны достаточно давно, эффект угнетения развития апикальных меристем и ускорения старения стерильных культур очень важно преодолевать при микроразмножении такой культуры как картофель, где, как раз, и используют газопроницаемые ватные пробки для пробирок. При микроразмножении плодовых и ягодных культур эти отрицательные моменты также имеют место, хотя не столь явно. Контроль состава воздуха внутри культивационных сосудов весьма затруднен, тем не менее, многие исследователи связывают ряд проблем, таких как витрификация, хлороз, отмирание апикальных частей и листьев, как раз с этим вопросом.

Предварительно нами была отработана схема культивирования растительных конгломератов почек и побегов в колбах объемом 250 мл с покрытием из ватно-марлевых дисков. Ватно-марлевые диски фиксировались на горлышке колбы термоусадочной пленкой, после чего на ее поверхности выполнялось вентиляционное отверстие, размером ¼ от максимально возможного. Это значение оптимально и было установлено нами ранее экспериментально в процессе соотнесения начального объема питательной среды в культивационном сосуде и площади испарения, что позволило обеспечить длительность беспересадочного культивирования до 1,5 мес.

Сравнение ватно-марлевого покрытия культивационного сосуда с пленочным на этапе пролиферации выявило очень существенное преимущество изучаемого варианта, поскольку на протяжении пассажа длительностью 1 мес. в первом случае культуры активно развивались, имели насыщенный зеленый цвет и формировали прямостоячие микропобеги длиной 3-6 см. Развитие конгломератов почек и побегов под пленкой шло неудовлетворительно, после двух недель начинал развиваться хлороз, к концу месяца в ряде колб отмечалась полная гибель конгломератов. Качество микрочеренков после элонгации под пленочным покрытием оказалось низким, побеги имели бледно-зеленую окраску и очень часто погибшую апикальную часть (рис. 1). Высадка их на укоренение была малопродуктивной из-за низкой укореняемости.

Напротив, из каждой колбы, покрытой ватно-марлевым диском в течение 1 мес. после высадки было получено в среднем от 20 до 30

Рис. 1 - Элонгация in vitro черешни сорта Фатеж при   различных вариантах укупорки культивационных сосудов (слева – пленка, справа – ватно-марлевый диск)

 

микрочеренков черешни и вишни высотой 4-5 см, которые имели высокие технологические кондиции, и, впоследствии, показали более высокую укореняемость, которая была на уровне 75-90%, что превышало укореняемость микрочеренков высотой 2-3 см на 30-40%, а также степень развития корневой системы in vitro. Очень существенным, на наш взгляд, оказался тот факт, что микрочеренки длиной 4-5 см часто имели толщину в базальной части 1,5-2 мм.

Для повышения эффективности доращивания адаптированных микрорастений нами на протяжении уже ряда лет разрабатывается технология предпосадочной подготовки материала на основе кратного моделирования периода покоя в искусственных условиях в течение календарного года [2]. Руководствуясь знанием процессов роста и развития многолетних растений в открытом грунте, а, именно тем, что до 80% годичного прироста побегов за вегетацию достигается в течение 1,5 мес. весенне-летнего периода [3], изучали циклическую схему доращивания адаптированных микрорастений ряда многолетних растений с периодом вегетации 1,5 мес. и покоя 2-2,5 мес.  Сделанные ранее наблюдения выявили то, что микрорастения при адаптации ведут себя очень сходно, завершая ростовые процессы в течение 1,5 мес. и потом не возобновляют их при благоприятных условиях в течение 3-6 мес.

В настоящих исследованиях ситуация была аналогичной, остановку роста регистрировали даже при адаптации микрорастений, которые проходили период покоя в искусственных условиях в состоянии пробирочных растений.  Как видно из рис. 2, прирост в течение первого ростового цикла у черешни составил порядка 5 см, что было в 2-2,5 раза больше, чем при адаптации микрорастений непосредственно после укоренения. После периода покоя в искусственных условиях, в ходе второго ростового цикла у вишни сорта Память Еникеева регистрировали приросты в пределах 30-40 см.

 

Рис. 2 - Ростовые циклы адаптированных микрорастений косточковых пород в течение календарного года (слева - черешня сорта Фатеж (1-й ростовой цикл), справа -  вишня сорта Память Еникеева (2-й ростовой цикл)

 

Практическая реализация схемы циклического доращивания адаптированных микрорастений косточковых культур в искусственных условиях в течение календарного года позволяет исключить ряд проблем, связанных со значительными потерями материала in vitro, при переводе больших партий в открытый грунт и сокращает срок доращивания до 1 вегетации в естественных условиях.

Литература

1. Sedlák J., Paprštein F. In vitro shoot proliferation of sweet cherry cultivars Karešova and Rivan / Hort. Sci.- Vol. 35, 2008 (3). - P. 95–98
2. Kornatskiy S.A. Innovative approaches to growing seedlings of sweet cherry using the method in vitro/ “Global Science and Innovation”: Materials of the VI International Scientific Conference, November 18-19^th 2015 - Chicago. USA. 2015– V.2. – P. 192 - 195
3. Физиология плодовых растений / Пер. с нем. /Под ред. Р.П. Кудрявца. – М.: Колос, 1983. – 416 с.

References

1. Sedlák J., Paprštein F. In vitro shoot proliferation of sweet cherry cultivars Karešova and Rivan / Hort. Sci.- Vol. 35, 2008 (3). - P. 95–98
2. Kornatskiy S.A. Innovative approaches to growing seedlings of sweet cherry using the method in vitro / “Global Science and Innovation”: Materials of the VI International Scientific Conference, November 18-19^th 2015 - Chicago. USA. 2015– V.2. – P. 192 - 195
3. Fiziologija plodovyh rastenij [Physiology of the horticultural plants] / Per. s nem. /Pod red. R.P. Kudrjavca. – M.: Kolos, 1983. – 416 s.