STUDY OF THE DEGREE OF HYDRATION IN THE NUCLEUS PULPOSUS OF THE HUMAN INTERVERTEBRAL DISC USING INFRARED SPECTROSCOPY
STUDY OF THE DEGREE OF HYDRATION IN THE NUCLEUS PULPOSUS OF THE HUMAN INTERVERTEBRAL DISC USING INFRARED SPECTROSCOPY
Abstract
The aim of the study is to evaluate the content of clear and bound water in human nucleus pulposus using Fourier-transform infrared spectroscopy. 11 samples of nucleus pulposus tissue were examined, which had been removed during elective puncture decompression nucleoplasty procedures with simultaneous measurement of intradiscal pressure (Neurosurgery Department, Kineshma City Clinical Hospital). The infrared spectra were recorded using a TENSOR-27 Fourier transform spectrometer (Bruker Optics, Germany) and analysed using the OPUS-6 software. Using the Lorentz Fourier deconvolution method, absorption bands of clear and bound water were isolated, excluding the contribution of valence vibrations of N–H peptide bonds in collagen. The spectral onco/hydro (sO/H) index was calculated as the ratio of the difference in the peak areas of bound and free water to their sum (ranging from +1 — bound water only — to –1 — free water only). A comparison was made with a model index calculated using a geometric model of the permeability of the pulpous nucleus. An increase in intradiscal pressure was accompanied by a bathochromic shift of the spectral maxima in the 3200–3650 cm⁻¹ region and an increase in the proportion of bound water. For samples with intradiscal pressure of 40, 30 and 25 cm H₂O, the spectral index was +0.37, +0.13 and –0.11 respectively, which is in good agreement with the model’s calculated values (+0.35; +0.11; –0.08). The Fourier-transform infrared spectroscopy method, combined with deconvolution analysis, enables the quantitative determination of the ratio of clear to bound water in the nucleus pulposus, which can serve as a tool for assessing the condition of the proteoglycan matrix.
1. Введение
Межпозвонковый диск (МПД) человека анатомически делится на три составляющие части: внутренняя (центральная) часть — пульпозное ядро (ПЯ), наружный участок — фиброзное кольцо (ФК) и третья составляющая — тонкий слой гиалинового хряща (замыкательная пластинка), который сверху и снизу отделяет диск от тел смежных позвонков. В большинстве случаев болевой синдром в спине человека
обусловлен дегенерацией МПД. Считается, что дегенеративно-дистрофическому процессу в МПД предшествует повреждение, инициирующее каскад патологических реакций, сначала в гиалиновой пластинке с последующим распространением на ПЯ и ФК . Изменения матрикса в ПЯ включают в себя фрагментацию протеогликановых агрегатов (ПГА) с последующим снижением их концентрации. При этом уменьшается количество связанной воды и жизнеспособных хондроцитов , .По данным Глобального исследования бремени болезней 2021, в 2020 году боль в нижней части спины зарегистрирована у 619 млн человек, к 2050 году прогнозируется рост числа случаев до 843 млн, что делает данное состояние ведущей причиной инвалидности в мире
. У лиц старше 65 лет распространённость дегенеративных изменений межпозвонковых дисков превышает 90% . Ключевым патогенетическим звеном дегенерации является прогрессирующая потеря протеогликанов, приводящая к снижению содержания воды в пульпозном ядре и нарушению его биомеханических свойств , .Основным структурным компонентом ПЯ и ФК является фибриллярный белок коллаген, погружённый в гель ПГА. Сеть коллагена выполняет две основные функции: армирующую и связывающую ПГА. Основой ПГА является полимерная гиалуроновая кислота (ГК) — несульфатированный глюкозаминогликан, мономер которой образован D-глюкуроновой кислотой и N-ацетил-D-глюкозамином. Химическая природа веществ, входящих в протеогликаны МПД, обеспечивает отрицательный заряд их макромолекулам, притягивающий дипольные молекулы воды. Поэтому вода является одним из основных компонентов ПЯ МПД; её содержание варьирует от 77% у лиц старшей возрастной группы до 90 % у младенцев
. Связывание воды и набухание ПЯ определяют упруго-эластические свойства ткани. К факторам, вызывающим дегенерацию МПД, относят снижение проницаемости краевых гиалиновых пластинок, чрезмерные физические нагрузки и ряд других причин .Для детального анализа водных, в том числе и гетерогенных, систем давно используются методы ИК-спектроскопии. Полоса валентных колебаний ОН-групп находится в диапазоне волновых чисел 3100–3700 см⁻¹, однако её контур представляет собой широкую слабо разрешённую кривую. Для выделения индивидуальных компонент применяют Фурье-деконволюцию
. Подход с использованием этого метода показал, что структуру валентной полосы ОН можно описать несколькими спектральными компонентами: низкочастотный максимум 3000–3100 см⁻¹, максимумы около ~3200, ~3300 см⁻¹, самая интенсивная полоса ~3450 см⁻¹ и высокочастотные полосы ~3550 и ~3630 см⁻¹ . Высокочастотные полосы относятся к колебаниям ОН-групп с разорванной водородной связью; полоса ~3450 см⁻¹ — к ОН-группам с ослабленными водородными связями; низкочастотная полоса 3000–3100 см⁻¹ обусловлена ассоциатами с прочной тетраэдрической координацией, подобной льду . В этом же диапазоне находится полоса амида А коллагена (~3400 см⁻¹), относящаяся к валентному колебанию N–H связи, что существенно усложняет анализ водно-белковых систем . В литературе имеются примеры оценки содержания свободной и связанной воды в системе коллагеновых волокон с помощью ИК-спектроскопии, в том числе с использованием Фурье-преобразований . Современные спектроскопические подходы рассматриваются как перспективные для неинвазивной оценки состояния межпозвонковых дисков .Научная новизна настоящего исследования заключается в том, что впервые гидратацию пульпозного ядра оценивают количественно по ИК-спектрам с Фурье-деконволюцией, раздельно определяя свободную и связанную воду в операционном материале. Также впервые спектральный индекс сопоставлен с модельным индексом, рассчитанным по геометрической модели проницаемости пульпозного ядра.
Цель исследования — оценить содержание свободной и связанной воды в ткани пульпозного ядра человека методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием.
2. Методы и принципы исследования
Дизайн исследования: одномоментное (поперечное) обсервационное исследование образцов ткани, полученных интраоперационно.
Материалом служили ткани удалённого фрагмента ПЯ во время плановых операций пункционной декомпрессивной нуклеопластики МПД с одновременным измерением внутридискового давления (ВДД)
(нейрохирургическое отделение городской клинической больницы г. Кинешма). Получено 11 образцов; измеренные значения ВДД составили от 25 до 60 см вод. ст. Образцы выкладывали на KRS-стекло, хранили не более суток при температуре около 4 °С в герметичных контейнерах. Перед записью спектров образцы термостатировали при 22 °С.ИК-спектры регистрировали на Фурье-спектрометре TENSOR-27 (Bruker Optics, Германия) и обрабатывали программным обеспечением OPUS‑6. Для разделения вкладов свободной и связанной воды применяли Фурье-деконволюцию по модели Лоренца; полосу валентных колебаний N–H пептидных связей коллагена исключали из расчёта. Спектральный индекс онко/гидро (сО/Г) вычисляли как отношение разности площадей пиков связанной и свободной воды в диапазоне 3200–3650 см⁻¹ к их сумме; индекс принимает значения от +1 (только связанная вода) до –1 (только свободная вода). Для сопоставления использовали геометрическую модель проницаемости ПЯ, разработанную авторами
, , .3. Основные результаты
Упругость ткани ПЯ определяется присутствием воды, иммобилизованной комплексом коллагеновых фибрилл (КФ) и ПГА. Деструкция ПГА высвобождает воду и снижает упругость ядра. «Связанной» считают воду, удерживаемую силами межмолекулярного взаимодействия компонентами ПЯ; «свободной» — воду, находящуюся в пространстве между волокнами коллагена с растворёнными в ней продуктами распада ГК. Полосы поглощения этих двух типов воды в ИК-спектре различны, так как на них по-разному действуют ван-дер-ваальсовы, ионно-электростатические силы и водородные связи
, . Положения максимумов поглощения обоих типов воды отличаются от модельных, поскольку ионная сила этих водных систем различается .Полученные спектры (рис. 1) представляют собой типичные спектры коллагена
, в которых выделяются характерные для белка области. Амид А — широкая полоса поглощения с максимумом при 3295 см⁻¹, комбинированная, обусловленная колебательными модами воды и валентными колебаниями N–H пептидных связей коллагена.
ИК-спектр ткани пульпозного ядра
ВДД 50 см вод. ст.
Нормализованные путём приведения к базовой линии ИК-спектры образцов ткани ПЯ с внутридисковым давлением 25 (1) и 55 (2) см вод. ст
Фурье-деконволюция образцов ткани ПЯ с внутридисковым давлением 25 (1) и 55 (2) см вод. ст
В табл. 1 представлены зависимости ВДД от индекса онко/гидро, полученные по результатам ИК-спектроскопии и по геометрической модели проницаемости ПЯ. Модель подбирали по наиболее близким значениям ВДДм к экспериментальному ВДДэ.
Таблица 1 - Сопоставление спектрального и модельного индексов онко/гидро
ИК-спектроскопия Образцы ткани № 5, 6, 2 | Подобранная по проницаемости геометрическая модель | ||
ВДДэ, см вод. ст. | Индекс сО/Г | ВДДм, см вод.ст. | Индекс мО/Г |
40 | +0.37 | 36 | +0.35 |
30 | +0.13 | 26 | +0.11 |
25 | -0.11 | 22 | -0.08 |
Графическая зависимость ВДД от индекса онко/гидро
4. Обсуждение
Полученные данные согласуются с представлениями о том, что при дегенерации МПД происходит снижение рН в центре ПЯ до 6,4 вследствие лактат-ацидоза
. Уменьшение рН подавляет диссоциацию кислых групп ПГА, суммарный заряд падает, количество связанной воды уменьшается, а свободной — возрастает. В кислой среде ускоряется выработка гиалуронидазы , хотя её активность существенно не изменяется . Это ведёт к фрагментации ПГА и вымыванию глюкозаминогликанов. ПЯ дегидратируется, внутридисковое осмотическое давление падает, высвободившаяся вода фильтруется через коллагеновую сеть. Доказано, что при острых и хронических дегенеративных изменениях МПД содержание ГК в ПЯ существенно различается; концентрация ГК пропорциональна осмотическому давлению . Период полураспада ГК, протекающий под действием фермента гиалуронидазы, в организме человека составляет 2 суток, однако непрерывный синтез ГК приводит к обновлению её состава каждые 2–3 дня . Молекулярная масса ГК варьирует в широких пределах (от 5000 до 20 000 000 Да); например, средняя ММ макромолекул ГК в синовиальной жидкости человека составляет 3 140 000 Да . Волокна коллагена, входящие в состав ПЯ, толщиной 1,5 нм упакованы в фибриллы диаметром до 300 нм; в состав коллагена также входит связанная вода, играющая существенную роль в механизме образования коллагеновых фибрилл . Сформировавшиеся КФ практически не смачиваются свободной водой и не оказывают сопротивления движению жидкости вдоль волокна . МПД в поясничном отделе позвоночника способен выдерживать одноосное давление до 2,5 МПа .Сравнение спектрального и модельного индексов показывает хорошее согласие: для трёх образцов различия не превышают 0,05, что подтверждает адекватность как спектрального метода оценки гидратации, так и геометрической модели проницаемости ПЯ. Следует отметить, что значение ВДДм в модели отличается для разных значений времени падения измерительной капли (2, 3 и более секунд), что следует учитывать при сопоставлении
, , .В недавнем исследовании Vettese et al.
показано, что процессы децеллюляризации и стерилизации коллагеновых матриксов сопровождаются изменением их гидратации и структуры поперечных сшивок, что подчёркивает важность контроля содержания воды в тканях на основе коллагена. Это согласуется с нашими результатами о связи степени гидратации ПЯ с его функциональным состоянием.5. Заключение
В работе исследованы ИК-спектры образцов ткани ПЯ МПД с различной степенью деструкции ПГА. Образцы получены во время пункционной декомпрессивной нуклеопластики с одновременным измерением внутридискового давления (ВДДэ). Для количественной оценки использован безразмерный параметр — спектральный индекс онко/гидро (сО/Г), вычисляемый по результатам деконволюции и Фурье-анализа полосы поглощения 3200–3650 см⁻¹. Полученные значения сО/Г сопоставлены с модельным индексом мО/Г, рассчитанным по геометрической модели проницаемости ПЯ. Сравнение указывает на возможность применения предложенного спектрального подхода для оценки гидратированности пульпозного ядра и состояния его протеогликанового матрикса.