BIOCOMPATIBILITY OF IMPLANTS BASED ON P-NEMA HYDROGEL

Гидрогели представляют собой системы, образованные сшитыми полимерными цепями с трехмерной сетчатой структурой, способные поглощать большое количество жидкости. Благодаря высокому содержанию воды, мягкой структуре и пористости, гидрогели могут имитировать физические, химические и биологические свойства нативных тканей организма

, , . Такие особенности гидрогелей оказались востребованными в различных областях биомедицины. В частности, это создание новых биоматериалов, адресная доставка лекарственных средств, инженерия тканей и регенеративная медицина , .

Большое разнообразие синтетических и природных гидрогелей позволяет выбрать наиболее подходящие полимеры для решения той или иной задачи. Среди прочих, гидрогель поли-2-гидроксиэтилметакрилата (р-HEMA) является перспективным материалом для аппликации в различных областях медицины

, . Анализ биосовместимости гидрогеля p-HEMA с различными типами клеток in vitro показал обнадеживающие результаты. Так, выявлено отсутствие цитотоксичности, быстрое прорастание пористой матрицы полимера элементами соединительной ткани и клетками крови, низкий уровень воспалительных маркеров, эффективная дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток, успешная пролиферация хондроцитов и фибробластов  , .

Вместе с тем текущие стандарты исследований in vitro и in vivo (ISO-10993) для оценки биологической реакции на материалы имплантатов не достаточны для прогнозирования приемлемости их использования в качестве медицинских изделий в клинике

. Использование любых имплантатов может приводить к появлению ряда проблем в организме, которые влекут за собой повреждение тканей и возможную потерю их функциональности . Неблагоприятные эффекты, вызванные иммунным ответом пациента на инородное тело, являются серьезной проблемой на пути к успеху использования новых материалов в клинической практике , .

Синтетические материалы, используемые для создания имплантатов, как правило, не являются антигенными и, следовательно, не индуцируют образование специфических антител, участвующих в адаптивном иммунном ответе. Однако молекулярная структура полимеров может значительно повлиять на функциональную активность фагоцитов (нейтрофилов, макрофагов, дендритных клеток), ответственных за реализацию врожденного иммунитета

, . Адаптивные иммунные реакции на имплантат сопряжены с развитием хронического воспаления с участием клеток иммунной системы, презентирующих антигены. Таким образом, врожденные и адаптивные иммунные реакции на имплантат могут перекрещиваться и зависеть от его материала .

Настоящая работа посвящена изучению реакции регионарных лимфатических узлов в ответ на имплантацию гидрогеля р-НЕМА в костно-хрящевые дефекты дистальных эпиметафизов бедренной кости с целью выяснения биосовместимости синтетического полимера. Объектом исследования послужили результаты морфометрического анализа структурной организации и клеточного состава морфофункциональных зон лимфатических узлов в области лимфосбора. Такой подход является незаменимым в изучении реакции организма как единой биологической системы. Подколенные лимфатические узлы относятся к узлам первого порядка, по ареалу лимфосбора — соматическими.

2.1. Материалы исследования

Настоящая работа является логическим продолжением и опирается на материалы предварительного исследования, выполненного с целью оценки особенностей репаративного хондрогенеза и остеогенеза при имплантации p-HEMA в костно-хрящевые дефекты у кроликов

. Препараты лимфатических узлов для морфологического исследования были получены непосредственно после выведения животных из эксперимента. Эксперимент был выполнен на семи кроликах. В качестве референсных значений, использовали показатели, полученные при исследовании лимфоузлов трех интактных животных (интактная серия — ИС; количество исследованных лимфоузлов, n=6). Четырем кроликам создавали стандартные большие костно-хрящевые дефекты на пателлярной поверхности дистального эпиметафиза бедренной кости в области поверхности пателло-феморального сочленения. Дефекты имели форму цилиндра, диаметром 5 мм, высотой 5,5 мм. Два кролика с четырьмя дефектами, незамещенными имплантатами, составили контрольную серию (КС) исследования (n=4). Еще у двух животных дефекты были замещены имплантатами р-НЕМА — опытная серия (ОС) (n=4).

Детали оперативного вмешательства, имплантации гидрогеля р-НЕМА, а также его физико-химические свойства подробно изложены нами ранее

. Кратко, были использованы половозрелые кролики самцы (возраст 5 месяцев, вес 2,8–3,5 кг) породы «Советская Шиншилла». Содержание, оперативные вмешательства и эвтаназия животных проводились в соответствии с требованиями и принципами биомедицинских исследований с участием позвоночных животных (European Convention, 1986; 1998) и были одобрены этическим комитетом Уральского государственного медицинского университета (протокол № 2 от 28 февраля 2020 года).

Цилиндрические имплантаты р-НЕМА диаметром 5 мм, высотой 5,5 мм были изготовлены методом радикальной полимеризации в водном растворе мономера (гидроксиэтилметакрилата — HEMA) при 70 °С в присутствии сшивающего агента – N,N’-метилендиакриламида. Концентрации мономера и сшивающего агента обеспечили формирование сетчатой полимерной структуры, в которой мольное соотношение узлов сетки и звеньев в линейных фрагментах составляло 1:100.

Продолжительность эксперимента составляла 30 суток. В течение этого срока, гибели и гнойных осложнений у оперированных животных не наблюдалось.

2.2. Методы исследования

Материал для морфологического исследования (подколенные лимфатические узлы) отделяли от окружающей жировой клетчатки, оценивали размер, форму и окраску; фиксировали 48–72 часа в 10% нейтральном забуференном формалине (BioOptica, Италия). Для гистологической проводки использовали методику «Изопропанол — минеральное масло»

, образцы уплотняли парафином (Биовитрум, Россия).

Срезы готовили на микротоме МЗП-01 «ТЕХНОМ» (Россия). Серии срезов лимфоузлов, толщиной 5 микрометров, проводили по длинной оси органа, на уровне ворот и полюсов. В качестве обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин. Для выявления компонентов соединительной ткани срезы окрашивали по методу Ван-Гизона.

Для описательной морфологии использовали световой микроскоп Micros MS300 (Австрия). Оцифровку препаратов выполняли на сканирующем микроскопе 3DHISTECH PANNORAMIC Midi (Венгрия) с использованием программы Pannoramic Viewer (Венгрия).

Для изучения соотношения площадей структурных элементов лимфатических узлов и их клеточного состава применяли морфометрию и дифференцированный подсчет клеточных элементов в различных функциональных зонах. В каждой зоне подсчитывали 500 клеток. При подсчете численной плотности клеток площадь поля составляла 0,025 мм2.

2.3. Статистический анализ

Результаты представлялись в виде X±m, где Х — среднее арифметическое, m — ошибка среднего арифметического. При оценке различий между двумя независимыми выборками использовали параметрический критерий Стьюдента. Допустимым уровнем статистической значимости принимали p≤0,05. Статистический анализ данных был выполнен с использованием лицензионного программного обеспечения «Statistica 6.0».

Анализ структурной организации и клеточного состава анатомо-функциональных зон лимфатических узлов способен дать объективную оценку реакции лимфатической системы на дестабилизирующие факторы. Подколенные лимфатические узлы, животных всех исследуемых серий, макроскопически имели овально-бобовидную форму, с разной степенью выраженности рельефа поверхности, от гладких и бугристых (преимущественно ИС, КС) до сильно бугристых (преимущественно ОС). Окраска органов имела неоднородность, соответственно, от бежевого и коричневого до темно-коричневого. Это обусловлено количеством капилляров и степенью наполнения структур органа кровью, а также количеством и размером лимфоидных узелков в корковом веществе.

Гистологическая структура регионарных лимфатических узлов была сохранена, клеточная атипия отсутствовала у животных всех исследуемых серий. Примеры визуализации лимфоузлов интактной и двух экспериментальных серий приведены на рис. 1.

Площадь лимфатических узлов была примерно одинаковой в ИС и КС. В ОС этот показатель был значимо увеличен, прежде всего, за счет сегментарного расширения коркового вещества. Капсула лимфатических узлов образована плотной соединительной тканью, напряжена, пучки коллагеновых волокон расположены параллельно поверхности. Толщина капсулы в ОС оказалась меньше, чем в ИС и КС примерно в 2,0 и 2,7 раза, соответственно. Это может быть обусловлено растяжением капсулы за счет увеличения объёма лимфоузла. Потенциально, возможно вовлечение более тонких механизмов, например, прямое ингибиторное влияние провоспалительного интерлейкина IL-1β на гладкие миоциты капсулы лимфатических узлов вплоть до полного прекращения спонтанной фазной их активности при высоких дозах IL-1β

, .

У всех прооперированных животных были выявлены признаки небольшого увеличения интенсивности циркуляции лимфы (небольшое расширение краевых синусов). Площадь коркового вещества (включающего узелковую и диффузную части) в ИС и КС не различались, в ОС данный показатель имел тенденцию к увеличению (p > 0,05).

В строении лимфоидных узелков животных экспериментальных серий (КС и ОС) по сравнению с ИС были выявлены некоторые отличия. Количество вторичных лимфоидных узелков, относительно их общего числа, во всех сериях не различалось и составляло ~70%. Вместе с тем, часть узелков в КС и ОС была расширена, формируя бугристый рельеф поверхности лимфатического узла. Морфологически, граница между внутриузелковыми структурами в экспериментальных сериях имела четко дифференцированную границу. Герминативные центры были выражены, в ОС с отчетливо выявляемой мантийной зоной. Было отмечено увеличение плотности клеток герминативных центров и абсолютного количества центробластов (лимфобластов) и центроцитов (пролимфоцитов) в КС (лимфобласты 192,3±12,1/0,025 мм2, пролимфоциты 158,4±14/0,025 мм2) и ОС (лимфобласты 160,3±36,1/0,025 мм2, пролимфоциты 143,8±31,1/0,025 мм2) по сравнению с ИС (лимфобласты 83,4±12,9/0,025 мм2, пролимфоциты 73,0±6,1/0,025 мм2). При этом в группе КС по отношению ИС установленные различия были статистически значимыми (p<0,05).

Таким образом, были установлены признаки фолликулярной гиперплазии, которая ассоциируется преимущественно с активацией В-клеточного компартмента

. Характер и сроки развития выявленных изменений в узелках коркового вещества соответствуют описанным в литературе изменениям в регионарных лимфоузлах при травме большеберцовой кости. Системный ответ организма, включающий и изменения в регионарных лимфоузлах (лимфаденопатию, реакцию центров размножения, активацию В-лимфоцитов, зависимую от Т-фолликулярных хелперов — Tfh) характеризуется как посттравматический «адаптивный аутоиммунный ответ» , .

У животных экспериментальных серий ОС и КС в диффузной части коркового вещества, относящейся к тимус-зависимой зоне, было выявлено значительное увеличение количества пролимфоцитов по отношению к ИС: 12,6±3,9/0,025 мм2, 13,1±1,0/0,025 мм2 (p <0,05) и 5,0±0,6/0,025 мм2, соответственно. В ОС и КС в сравнении с ИС наблюдалась тенденция к увеличению количества макрофагов: 10,6±4,3/0,025 мм2, 11,2±3,1/0,025 мм2 и 6,2±1,3/0,025 мм2, соответственно. Кроме того, у кроликов экспериментальных серий были выявлены плазмоциты (0,6±0,6/0,025 мм2 в ОС и 4,8±1,5/0,025 мм2 в КС) и эозинофилы (2,5±0,8/0,025 мм2 в ОС и 11,3±3,5/0,025 мм2 в КС), чего не наблюдалось у животных интактной серии. Рисунок 2 иллюстрирует пример эозинофилии коркового вещества лимфатического узла в КС.

Тяжи мозгового вещества были хорошо выражены. Количество молодых лимфоидных элементов (лимфобласты и пролимфоциты) в мозговом веществе имело тенденцию к увеличению, однако статистически значимых отличий ни в одной из групп нами не выявлено. По аналогии с другими функциональными зонами было отмечено появление эозинофилов: 4,2±1,4/0,025 мм2 в группе КС и 5,0±2,2/0,025 мм2 в группе ОС, тогда как в группе ИС эозинофилы не были обнаружены в срезах ни в одной из зон лимфатических узлов.

Во всех морфофункциональных зонах лимфоузла обращает на себя внимание увеличение количества эозинофилов, важнейших участников аллергического воспаления. Вместе с тем в настоящее время эозинофилы рассматривают в качестве клеток, осуществляющих иммунорегуляторные реакции, вызывающие как развитие, так и ограничение иммунного ответа

.

Таким образом, выявленные морфологические изменения и количественные различия клеточного состава в герминативных центрах, диффузной части коркового вещества, паракортикальной области, а также в мозговом веществе в экспериментальных сериях имели одинаковую направленность и незначительно отличались своей выраженностью. Следовательно, данные изменения не обусловлены имплантацией гидрогеля р-НЕМА в костно-хрящевые дефекты. Вероятно, установленные факты связаны с высвобождением молекулярных паттернов, ассоциируемых с повреждением (damageassociated molecular patterns — DAMPs) тканей и клеточного стресса во время операции и в послеоперационном периоде, которые скрыты от распознавания клетками иммунной системы в физиологических условиях

. DAMPs являются ключевыми молекулами, запускающими стерильное воспаление, участвуют в формировании реакций адаптивного иммунитета и аутоиммунных процессов .

В рамках экспериментальной модели на животных по оценке биосовместимости синтетического гидрогеля р-НЕМА, имплантированного в костно-хрящевые дефекты на бедренной кости, был установлен ряд закономерностей. А именно, у всех прооперированных кроликах (КС и ОС) по отношению к ИС в регионарных подколенных лимфатических узлах имели место признаки увеличения интенсивности циркуляции лимфы (небольшое расширение краевых синусов), активации лимфопоэза (увеличение количества молодых лимфоидных клеток, преимущественно в корковом веществе и паракортикальной области), умеренного повышения активности В-зависимых зон (расширение части лимфоидных узелков и их герминативных центров, возрастание плотности клеток фолликулов и «омоложение» их клеточного состава), увеличения количества эозинофилов и плазмоцитов во всех морфофункциональных зонах. Наиболее значимые изменения по сравнению с интактными животными выявлены преимущественно в корковом веществе. Установленные факты указывают на преобладание пролиферативных процессов над деструктивными в послеоперационный период.

Вместе с тем различия между КС и ОС не были значимыми, то есть реакции в регионарных лимфатических узлах непосредственно на внедрение имплантата из p-HEMA через 30 суток после операции не было выявлено. Предположено, что выявленные признаки реактивного изменения в лимфоузлах при имплантации р-НЕМА, вероятно, являются морфологическим субстратом адаптивного иммунного ответа на оперативное вмешательство и связаны с формированием костно-хрящевого дефекта.

Хорошая биосовместимость р-НЕМА на системном уровне открывает возможности использования этого материала для нужд биомедицинских технологий. В частности, нами рассматривается возможность аппликации микросфер р-НЕМА в качестве платформы для дендритных клеток, предварительно загруженных магнитными наночастицами оксида железа

. Предполагается, что адресная доставка таких композитов в лимфатические узлы с помощью внешнего магнитного поля позволит увеличить эффективность иммунотерапии.