1. Введение
Гидрогели представляют собой системы, образованные сшитыми полимерными цепями с трехмерной сетчатой структурой, способные поглощать большое количество жидкости. Благодаря высокому содержанию воды, мягкой структуре и пористости, гидрогели могут имитировать физические, химические и биологические свойства нативных тканей организма
[1][2][3][4][5]
Большое разнообразие синтетических и природных гидрогелей позволяет выбрать наиболее подходящие полимеры для решения той или иной задачи. Среди прочих, гидрогель поли-2-гидроксиэтилметакрилата (р-HEMA) является перспективным материалом для аппликации в различных областях медицины
[6][7][8][9]
Вместе с тем текущие стандарты исследований in vitro и in vivo (ISO-10993) для оценки биологической реакции на материалы имплантатов не достаточны для прогнозирования приемлемости их использования в качестве медицинских изделий в клинике
[10][11][12][13]
Синтетические материалы, используемые для создания имплантатов, как правило, не являются антигенными и, следовательно, не индуцируют образование специфических антител, участвующих в адаптивном иммунном ответе. Однако молекулярная структура полимеров может значительно повлиять на функциональную активность фагоцитов (нейтрофилов, макрофагов, дендритных клеток), ответственных за реализацию врожденного иммунитета
[12][13][13]
Настоящая работа посвящена изучению реакции регионарных лимфатических узлов в ответ на имплантацию гидрогеля р-НЕМА в костно-хрящевые дефекты дистальных эпиметафизов бедренной кости с целью выяснения биосовместимости синтетического полимера. Объектом исследования послужили результаты морфометрического анализа структурной организации и клеточного состава морфофункциональных зон лимфатических узлов в области лимфосбора. Такой подход является незаменимым в изучении реакции организма как единой биологической системы. Подколенные лимфатические узлы относятся к узлам первого порядка, по ареалу лимфосбора
—
2. Материалы и методы
Настоящая работа является логическим продолжением и опирается на материалы предварительного исследования, выполненного с целью оценки особенностей репаративного хондрогенеза и остеогенеза при имплантации p-HEMA в костно-хрящевые дефекты у кроликов
[14]——
Детали оперативного вмешательства, имплантации гидрогеля р-НЕМА, а также его физико-химические свойства подробно изложены нами ранее
[14]
Цилиндрические имплантаты р-НЕМА диаметром 5 мм, высотой 5,5 мм были изготовлены методом радикальной полимеризации в водном растворе мономера (гидроксиэтилметакрилата
—
Продолжительность эксперимента составляла 30 суток. В течение этого срока, гибели и гнойных осложнений у оперированных животных не наблюдалось.
Материал для морфологического исследования
—[15]
Срезы готовили на микротоме МЗП-01 «ТЕХНОМ» (Россия). Серии срезов лимфоузлов, толщиной 5 микрометров, проводили по длинной оси органа, на уровне ворот и полюсов. В качестве обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин. Для выявления компонентов соединительной ткани срезы окрашивали по методу Ван-Гизона.
Для описательной морфологии использовали световой микроскоп Micros MS300 (Австрия). Оцифровку препаратов выполняли на сканирующем микроскопе 3DHISTECH PANNORAMIC Midi (Венгрия) с использованием программы Pannoramic Viewer (Венгрия).
Для изучения соотношения площадей структурных элементов лимфатических узлов и их клеточного состава применяли морфометрию и дифференцированный подсчет клеточных элементов в различных функциональных зонах. В каждой зоне подсчитывали 500 клеток. При подсчете численной плотности клеток площадь поля составляла 0,025 мм2Missing Mark : sup.
Результаты представлялись в виде X±m, где Х
——
3. Результаты и обсуждение
Анализ структурной организации и клеточного состава анатомо-функциональных зон лимфатических узлов способен дать объективную оценку реакции лимфатической системы на дестабилизирующие факторы. Подколенные лимфатические узлы, животных всех исследуемых серий, макроскопически имели овально-бобовидную форму, с разной степенью выраженности рельефа поверхности, от гладких и бугристых (преимущественно ИС, КС) до сильно бугристых (преимущественно ОС). Окраска органов имела неоднородность, соответственно, от бежевого и коричневого до темно-коричневого. Это обусловлено количеством капилляров и степенью наполнения структур органа кровью, а также количеством и размером лимфоидных узелков в корковом веществе.
Гистологическая структура регионарных лимфатических узлов была сохранена, клеточная атипия отсутствовала у животных всех исследуемых серий. Примеры визуализации лимфоузлов интактной и двух экспериментальных серий приведены на рис. 1.
Подколенные лимфатические узлы кроликов
Микроанатомическая организация подколенных лимфатических узлов кроликов
| Серия | Площадь лимфатического узла, мм2Missing Mark : sup | мм2Missing Mark : sup | Площадь паракортикальной области, мм2Missing Mark : sup | мм2Missing Mark : sup | Площадь стромы, мм2Missing Mark : sup |
| ИC n=6 | 27,7 ± 5,1 | 9,9 ± 1,1 | 6,8 ± 2,0 | 8,4 ± 3,1 | 2,6 ± 0,9 |
| КС n=4 | 25,2 ± 1,5 | 9,9 ± 0,4 | 5,4 ± 1,5 | 6,4 ± 1,7 | 3,5 ± 0,4 |
| ОС n=4 | 36,4 ± 0,6 * | 16,3 ± 2,8 | 7,8 ± 2,7 | 9,6 ± 0,5 | 2,7 ± 0,7 |
Площадь лимфатических узлов была примерно одинаковой в ИС и КС. В ОС этот показатель был значимо увеличен, прежде всего, за счет сегментарного расширения коркового вещества. Капсула лимфатических узлов образована плотной соединительной тканью, напряжена, пучки коллагеновых волокон расположены параллельно поверхности. Толщина капсулы в ОС оказалась меньше, чем в ИС и КС примерно в 2,0 и 2,7 раза, соответственно. Это может быть обусловлено растяжением капсулы за счет увеличения объёма лимфоузла. Потенциально, возможно вовлечение более тонких механизмов, например, прямое ингибиторное влияние провоспалительного интерлейкина IL-1β на гладкие миоциты капсулы лимфатических узлов вплоть до полного прекращения спонтанной фазной их активности при высоких дозах IL-1β
[13][16]
У всех прооперированных животных были выявлены признаки небольшого увеличения интенсивности циркуляции лимфы (небольшое расширение краевых синусов). Площадь коркового вещества (включающего узелковую и диффузную части) в ИС и КС не различались, в ОС данный показатель имел тенденцию к увеличению (p > 0,05).
В строении лимфоидных узелков животных экспериментальных серий (КС и ОС) по сравнению с ИС были выявлены некоторые отличия. Количество вторичных лимфоидных узелков, относительно их общего числа, во всех сериях не различалось и составляло ~70%. Вместе с тем, часть узелков в КС и ОС была расширена, формируя бугристый рельеф поверхности лимфатического узла. Морфологически, граница между внутриузелковыми структурами в экспериментальных сериях имела четко дифференцированную границу. Герминативные центры были выражены, в ОС с отчетливо выявляемой мантийной зоной. Было отмечено увеличение плотности клеток герминативных центров и абсолютного количества центробластов (лимфобластов) и центроцитов (пролимфоцитов) в КС (лимфобласты 192,3±12,1/0,025 мм2Missing Mark : sup, пролимфоциты 158,4±14/0,025 мм2Missing Mark : sup) и ОС (лимфобласты 160,3±36,1/0,025 мм2Missing Mark : sup, пролимфоциты 143,8±31,1/0,025 мм2Missing Mark : sup) по сравнению с ИС (лимфобласты 83,4±12,9/0,025 мм2Missing Mark : sup, пролимфоциты 73,0±6,1/0,025 мм2Missing Mark : sup). При этом в группе КС по отношению ИС установленные различия были статистически значимыми (p<0,05).
Таким образом, были установлены признаки фолликулярной гиперплазии, которая ассоциируется преимущественно с активацией В-клеточного компартмента
[16]—[13][16]
У животных экспериментальных серий ОС и КС в диффузной части коркового вещества, относящейся к тимус-зависимой зоне, было выявлено значительное увеличение количества пролимфоцитов по отношению к ИС: 12,6±3,9/0,025 мм2Missing Mark : sup, 13,1±1,0/0,025 мм2Missing Mark : sup (p <0,05) и 5,0±0,6/0,025 мм2Missing Mark : sup, соответственно. В ОС и КС в сравнении с ИС наблюдалась тенденция к увеличению количества макрофагов: 10,6±4,3/0,025 мм2Missing Mark : sup, 11,2±3,1/0,025 мм2Missing Mark : sup и 6,2±1,3/0,025 мм2Missing Mark : sup, соответственно. Кроме того, у кроликов экспериментальных серий были выявлены плазмоциты (0,6±0,6/0,025 мм2Missing Mark : sup в ОС и 4,8±1,5/0,025 мм2Missing Mark : sup в КС) и эозинофилы (2,5±0,8/0,025 мм2Missing Mark : sup в ОС и 11,3±3,5/0,025 мм2Missing Mark : sup в КС), чего не наблюдалось у животных интактной серии. Рисунок 2 иллюстрирует пример эозинофилии коркового вещества лимфатического узла в КС.
Эозинофилия коркового вещества лимфатического узла (контрольная серия)
Тяжи мозгового вещества были хорошо выражены. Количество молодых лимфоидных элементов (лимфобласты и пролимфоциты) в мозговом веществе имело тенденцию к увеличению, однако статистически значимых отличий ни в одной из групп нами не выявлено. По аналогии с другими функциональными зонами было отмечено появление эозинофилов: 4,2±1,4/0,025 мм2Missing Mark : sup в группе КС и 5,0±2,2/0,025 мм2Missing Mark : sup в группе ОС, тогда как в группе ИС эозинофилы не были обнаружены в срезах ни в одной из зон лимфатических узлов.
Во всех морфофункциональных зонах лимфоузла обращает на себя внимание увеличение количества эозинофилов, важнейших участников аллергического воспаления. Вместе с тем в настоящее время эозинофилы рассматривают в качестве клеток, осуществляющих иммунорегуляторные реакции, вызывающие как развитие, так и ограничение иммунного ответа
[17]
Таким образом, выявленные морфологические изменения и количественные различия клеточного состава в герминативных центрах, диффузной части коркового вещества, паракортикальной области, а также в мозговом веществе в экспериментальных сериях имели одинаковую направленность и незначительно отличались своей выраженностью. Следовательно, данные изменения не обусловлены имплантацией гидрогеля р-НЕМА в костно-хрящевые дефекты. Вероятно, установленные факты связаны с высвобождением молекулярных паттернов, ассоциируемых с повреждением (damageassociated molecular patterns
—[18][19]
4. Заключение
В рамках экспериментальной модели на животных по оценке биосовместимости синтетического гидрогеля р-НЕМА, имплантированного в костно-хрящевые дефекты на бедренной кости, был установлен ряд закономерностей. А именно, у всех прооперированных кроликах (КС и ОС) по отношению к ИС в регионарных подколенных лимфатических узлах имели место признаки увеличения интенсивности циркуляции лимфы (небольшое расширение краевых синусов), активации лимфопоэза (увеличение количества молодых лимфоидных клеток, преимущественно в корковом веществе и паракортикальной области), умеренного повышения активности В-зависимых зон (расширение части лимфоидных узелков и их герминативных центров, возрастание плотности клеток фолликулов и «омоложение» их клеточного состава), увеличения количества эозинофилов и плазмоцитов во всех морфофункциональных зонах. Наиболее значимые изменения по сравнению с интактными животными выявлены преимущественно в корковом веществе. Установленные факты указывают на преобладание пролиферативных процессов над деструктивными в послеоперационный период.
Вместе с тем различия между КС и ОС не были значимыми, то есть реакции в регионарных лимфатических узлах непосредственно на внедрение имплантата из p-HEMA через 30 суток после операции не было выявлено. Предположено, что выявленные признаки реактивного изменения в лимфоузлах при имплантации р-НЕМА, вероятно, являются морфологическим субстратом адаптивного иммунного ответа на оперативное вмешательство и связаны с формированием костно-хрящевого дефекта.
Хорошая биосовместимость р-НЕМА на системном уровне открывает возможности использования этого материала для нужд биомедицинских технологий. В частности, нами рассматривается возможность аппликации микросфер р-НЕМА в качестве платформы для дендритных клеток, предварительно загруженных магнитными наночастицами оксида железа
[20]