INFLUENCE OF DRUG ON THE BASIS OF IONIZED SILVER ON BIOFILM FORMATION OF MICROORGANISMS

Матросова Л.Е.¹, Чередниченко Ю.В.², Тухтаманов А.В.³

¹ Доктор биологических наук,  «Казанский инновационный университет им. В.Г. Тимирясова (ИЭУП)»

² Кандидат биологических наук,

³ Аспирант,  «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»

ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ИОНИЗИРОВАННОГО СЕРЕБРА НА БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Аннотация

В статье представлены результаты исследования препарата на основе ионизированного серебра на биопленкообразование патогенных микроорганизмов. В качестве тест-культур для проведения опытов in vitro использовали Escherichia coli, Bacillus licheniformis и Proteus mirabilis, выделенных от коров, с диагнозом эндометрит. Воздействие препарата «Аквасепто» сопровождалось снижением процесса биопленкообразования и разрушением сформированных биопленок. Определены концентрации препарата оказывающие более выраженный эффект.

Ключевые слова: эндометрит крупного рогатого скота, серебро, препарат, патогенные бактерии, биопленкообразование.

Matrosova L.E.¹, Cherednichenko YU.V.², Tukhtamanov A.V.³

¹ PhD in biology, Kazan Innovative University named after V.G. Timiryasov (IEML)

² PhD in biology,

³ Postgraduate student, Federal Center of the toxicological, biological and radiation safety

INFLUENCE OF DRUG ON THE BASIS OF IONIZED SILVER ON BIOFILM FORMATION OF MICROORGANISMS

Abstract

Results of research of drug on the basis of ionization silver «Akvasepto» on biofilm formation of pathogenic microorganisms are presented in article. As test cultures for carrying out experiences of in vitro used Escherichia coli, Bacillus licheniformis and Proteus mirabilis allocated from cows with the diagnosis an endometritis. Influence of the drug «Akvasepto» was followed by decrease in process of biofilm formation and destruction of the created biofilms. The concentration of drug rendering more expressed effect are defined.

Keywords: endometritis of cattle, silver, drug, pathogenic bacteria, biofilm formation.

Проблема воспроизводства поголовья крупного рогатого скота продолжает оставаться актуальной. Основная роль в бесплодии животных определяется заболеваниями половых органов. Многие ученые из всех акушерско-гинекологических заболеваний по широте распространения и наносимому ущербу на первое место относят послеродовые эндометриты. Главным результатом лечения коров при послеродовом эндометрите является восстановление их репродуктивной способности. В этом случае необходимо не только подавление патогенной микрофлоры, но и купирование воспалительного процесса, который нередко распространяется за пределы эндометрия в глубинные слои стенки матки [3].

Некоторые хронические инфекции вызываются бактериальными обитателями слизистых оболочек, растущими в виде биопленок (прикрепленное к поверхности сообщество микроорганизмов). Устойчивость бактерий в биопленке к антибиотикам в 1000 раз больше, чем у планктонных форм [1, 2, 5].

Поиск и внедрение препаратов для лечения эндометритов на различных стадиях его развития (острый, хронический и рецидивирующий) остается актуальным вопросом, имеющий теоретический и практический интерес.

В качестве перспективных средств лечения эндометритов коров можно рассмотреть препараты на основе ионизированного серебра. Наночастицы и ионы серебра способны неспецифически и необратимо связываться со многими молекулярными мишенями бактерий, поэтому выработка их устойчивости к серебру и его соединениям маловероятна. К тому же они оказывают системное противовоспалительное действие, индуцируя биохимические процессы, направленные на снижение воспаления даже тех участков, где прямой контакт тканей с наночастицами исключен [3].

Целью данной работы явилось изучение влияния препарата на основе ионов серебра на биопленкообразование патогенных бактерий.

В опытах использовали препарат «Аквасепто», разработанный д.б.н., профессором Ф.А. Сунагатуллиным и показавший эффективность при лечении маститов коров [4]. Препарат представляет собой катодную фракцию активированной воды (католита, «живой воды») и коллоидного серебра.

Материалы и методы. В качестве тест-культур использовали микроорганизмы, изолированные из мазков влагалищной слизи больных эндометритом и леченых антибиотиками коров. Идентификацию выделенных культур проводили общепринятыми микробиологическими методами. Культуры инкубировали при температуре 37⁰С в течение 24 ч на мясо-пептонном агаре.

Чувствительность выделенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам – канамицин, гентамицин, цефазолин, линкомицин и эритромицин исследовали диско-диффузионным методом

Для количественного учета интенсивности пленкообразования из суточных культур исследуемых микроорганизмов в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия готовили разведения 5 ЕД (5х10⁶ КОЕ/см³). Суспензию микроорганизмов готовили по отраслевому стандартному образцу мутности.

На первом этапе исследования в лунки полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносили 100 мкл микробной суспензии и препарат «Аквасепто» в различных концентрациях (25, 50 и 75 % на физиологическом растворе) в опытные лунки, и питательную среду в аналогичных количествах в контрольные образцы. Посевы инкубировали при непрерывном низкоамплитудном встряхивании в шейкере-инкубаторе PST-100 HL при температуре 37⁰С в течение 48 ч. В следующей серии опытов в лунки полистиролового планшета вносили 100 мкл микробной суспензии. Посевы инкубировали при непрерывном низкоамплитудном встряхивании в шейкере-инкубаторе PST-100 HL при температуре 37⁰С в течение 24 ч. Затем вносили препарат «Аквасепто» в различных концентрациях (25, 50 и 75% на физиологическом растворе) в опытные лунки и питательную среду в аналогичных количествах в контрольные образцы, с последующей инкубацией при 37⁰С в течение 24 ч.

Содержимое лунок удаляли и вносили на 30 мин. для окрашивания биопленок 0,1% водный раствор кристаллического фиолетового. После удаления из лунок раствора кристаллического фиолетового, проводили экстракцию красителя из биопленки в 96% этиловом спирте в течение 1 ч при комнатной температуре. Для построения калибровочной кривой готовили спиртовые растворы кристаллического фиолетового с концентрацией 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 25 и 50 мг/л. Измерение концентрации кристаллического фиолетового проводили на фотометре микропланшетном (Мultisсan FС) при длине волны 580 нм.

Результаты и их обсуждение. Микробиологическим исследованием влагалищной слизи больных и леченых коров в большинстве случаях изолировали Escherichia coli, Bacillus licheniformis и Proteus mirabilis.

Выделенные изоляты Escherichia coli были устойчивы в отношении линкомицина; Bacillus lisheniformis проявляли резистентность к линкомицину, эритромицину и цефазолину; Proteus mirabilis обладали устойчивостью к эритромицину. В отношении остальных антибиотиков – зона задержки роста составила не более 7-10 мм.

Все тестируемые изоляты обладали выраженной способностью к образованию биопленок in vitro.

Оценку влияния препарата «Аквасепто» на биопленкообразование бактерий проводили в 2 этапа. На первом оценивали влияние препарата на процесс биопленкообразования. Установлено, что 50% концентрация препарата снижала данный процесс у изолятов Escherichia coli (изолированных от больных коров) и Bacillus lisheniformis на 18,6 % (р<0,05) и 76,0 % (р<0,001) соответственно, относительно контроля. Под влиянием «Аквасепто» в концентрации 75 % у изолятов Escherichia coli (изолированных от леченых коров) и Proteus mirabilis биопленкообразование снижалось на 13,4 (р<0,05) и 26,6 % (р<0,01) соответственно, относительно контроля. Остальные концентрации препарата оказывали менее выраженный эффект по отношению к тестируемым бактериям.

На втором этапе определяли способность «Аквасепто» разрушать сформировавшиеся микробные биопленки. Было установлено, что наиболее эффективная концентрация препарата при которой он способен разрушать биопленки на 35,6 и 59,0 % (р<0,001) у изолята Escherichia coli (изолированных от больных коров) составила 50 и 75 % соответственно относительно контроля; у Escherichia coli (изолированных от леченых коров) на 32,1 % (р<0,001) относительно контроля при концентрации препарата      75 %; Bacillus lisheniformis и Proteus mirabilis на 74,0 и 37,0 % (р<0,001) соответственно, относительно контроля при 50 % концентрации «Аквасепто». Другие концентрации препарата по отношению к Escherichia coli, Bacillus lisheniformis и Proteus mirabilis показали менее выраженную эффективность.

Таким образом, проведенными исследованиями установлено, что препарат «Аквасепто» способен снижать процесс формирования и разрушать уже сформированные микробные биопленки in vitro. Причем, выделенные изоляты Escherichia coli от леченых коров в составе биопленок обладают более высокой устойчивостью к воздействию данного препарата и требуют более высокой его концентрации. Таким образом, препарат «Аквасепто» может применяться для лечения как острого, так и хронического или рецидивирующего (при формировании биопленок) воспалительного процесса, вызванного патогенной или условно-патогенной микрофлорой.

Список литературы / References

1. Данилова Т.А. Формирование биопленок стрептококками группы А разных типов и изучение влияния антибиотиков на этот процесс / Т.А. Данилова, Г.А. Данилина, А.А. Аджиева [и др.] // Журнал микробиология, эпидемиология и иммунобиология. – 2015. – №. 2 – С. 50-54.
2. Костюкова Н.Н. Пневмококковые биопленки как форма персистенции: образование, структура, роль в патогенезе, иммунный ответ / Н.Н. Костюкова, В.А. Бехало // Журнал микробиология, эпидемиология и иммунобиология. – 2015. – № 4. – С. 55-62.
3. Крутяков Ю.А. Эффективность нового антибактериального препарата Аргумистин при хроническом эндометрите у коров / Ю.А. Крутяков, П.Г. Симонов, Ю.А. Хаперский [и др.] // Ветеринария. – 2015. – № 10. – С. 42-45.
4. Пат. 2414226 Российская Федерация. Способ лечения коров, больных субклиническим маститом / П.В. Бурков, Ф.А. Сунагатуллин; заявитель и патентообладатель ФГОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины». - № 2009139587/15; заявл. 26.10.2009; опубл. 20.03.2011 г.
5. Терентьева Н.А. Характеристика образования, ингибирования и разрушения биопленок Yersinia pseudotuberculosis, формирующихся на абиотических поверхностях / Н.А. Терентьева, Н.Ф. Тимченко, Л.А. Балабанова [и др.] // Журнал микробиология, эпидемиология и иммунобиология. – 2015. – № 3 – С. 72-78.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Danilova T.A. Formirovanie bioplenok streptokokkami gruppyi A raznyih tipov i izuchenie vliyaniya antibiotikov na etot protsess [Biofilm formation by group a streptococci of various types and study of antibiotics on this process] / T.A. Danilova, G.A. Danilina, A.A. Adzhieva and others // Zhurnal mikrobiologiya, epidemiologiya i immunobiologiya [Journal of Microbiology Epidemiology and immunobiology]. – 2015. – № 2 – P. 50-54. [in Russian]
2. Kosyukova N.N. Pnevmokokkovyie bioplenki kak forma persistentcii: obrazovanie, struktura, rol v patogeneze, immunnyiy otvet [Pneumotropic causative agents in nasopharynx of children with respiratory pathology] / N.N. Kosyukova, V.A. Behalo // Zhurnal mikrobiologiya, epidemiologiya i immunobiologiya [Journal of Microbiology Epidemiology and immunobiology]. – 2015. – № 4. – P. 55-62. [in Russian]
3. Krutyakov Yu.A. Effektivnost novogo antibakterialnogo preparata Argumistin pri hronichescom endometrite u korov [Efficiency of a new antibacterial preparation Argumistin® at a chronic endometritis at cows] / Yu.A. Krutyakov, P.G. Simonov, Yu. A. Haperskiy and others // Veterinariya [Veterinary]. – 2015. –№ 10. – P. 42-45. [in Russian]
4. 2414226 Rossiyskaya Federatsiya. Sposob lecheniya korov, bolnyih subklinicheskim mastitom [The Russian Federation. Method of treatment of cows suffering from subclinical mastitis] / P.V. Burkov, F.A. Sunagatullin; zayavitel i patentoobladatel FGOU VPO «Uralskaya gosudarstvennaya akademiya veterinarnoy medicinyi» [applicant and patentee FGOU VPO «Ural state Academy of veterinary medicine»]. – № 2009139587/15; zayavl. 26.10.2009; opubl. 20.03.2011. [in Russian]
5. Terenteva N.A. Harakteristika obrazovaniya, ingibirovaniya i razrusheniya bioplenok Yersinia pseudotuberculosis, formiruuyschihsya na abioticheskih poverhnostyah [Characteristics of formation, inhibition and destruction of Yersinia pseudotuberculosis biofims forming on abiotic surfaces] / N.A. Terenteva, N.F. Timchenko, L.A. Balabanova and others // Zhurnal mikrobiologiya, epidemiologiya i immunobiologiya [Journal of Microbiology Epidemiology and immunobiology]. – 2015. – № 3 – P. 72-78. [in Russian]