РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ-АНТИОКСИДАНТОВ В ОРГАНИЗМЕ ПРИ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ ПАТОЛОГИЯХ

Гордеева А.Е.¹, Кочкина А.В.², Карадулева Е.В.³, Новоселов В.И.⁴

¹Аспирант, ФГБОУ ВПО Пущинский государственный институт; ²Аспирант, ФГБОУ ВО Тульский государственный университет; ³Кандидат биологических наук; ⁴Профессор, доктор биологических наук, ФГБУН Институт биофизики клетки РАН.

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ-АНТИОКСИДАНТОВ В ОРГАНИЗМЕ ПРИ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ ПАТОЛОГИЯХ

Аннотация

Целью данной работы является исследование локализации экзогенного пероксиредоксина 6 (Prx 6) при разных способах его введения в организм: В исследовании было показано, что экзогенный Prx 6 распределяется в организме и имеет свои сайты локализации в тканях, которые соответствуют локализации эндогенного Prx 6. Полученные результаты имеют важное значение для понимания механизмов защиты от окислительного стресса при свободно-радикальных патологиях.

Ключевые слова: пероксиредоксины, окислительный стресс.

Gordeeva A.E.¹, Kochkina A.V.², Karaduleva E.V.³, Novoselov V.I.⁴

¹Postgraduate student, Pushchino State Institute; ² Postgraduate student, Tula State University; ³PhD in Biology; Professor, PhD in Biology, Institute of cell’s biology RAS.

DISTRIBUTION OF EXOGENOUS ANTIOXIDANT ENZYMES IN THE BODY BY FREE RADICAL PATHOLOGY

Abstract

The purpose of this paper is to study the localization of exogenous peroxiredoxin 6 (Prx 6) for different methods of its administration in the organism. The study showed that the exogenous Prx 6 is distributed in the organism and has the sites of localization in the tissues, which correspond to the localization of the endogenous Prx 6. These results are important for the understanding of mechanisms of protection against oxidative stress in free radical pathology.

Keywords: peroxiredoxins, oxidative stress.

Введение. Активные формы кислорода (АФК) – продукты нормального клеточного метаболизма, которые включены в физиологические процессы. Для контролирования избыточного производства АФК в организме имеется мощная защитная система, представленная рядом эндогенных ферментов-антиоксидантов: супероксид дисмутазой, каталазой, ферментами глутатионового редокс-цикла тиоредоксином, пероксиредоксинами. Антиоксидантная защитная система сводит к минимуму протекание свободно-радикального окисления в клетках. С другой стороны, неконтролируемое производство АФК приводит к интенсификации свободно-радикальных процессов и в итоге к клеточной гибели. В условиях резкого повышения количества АФК эндогенная антиоксидантная система не способна в полной мере справится с нейтрализацией свободно-радикальных процессов [1,2].

В литературе приводиться более 100 заболеваний важным патогенетическим фактором развития, которых являются свободно-радикальные окислительные процессы [2]. Очевидно, что для ограничения негативного действия свободно-радикальных процессов необходимо повышение антиоксидантного статуса в повреждаемой ткани, путем применения экзогенных ферментов-антиоксидантов [1].

В этом случае при выборе экзогенного фермента-антиоксиданта особую роль играет его субстратная специфичность. В этом отношении наиболее предпочтительными являются пероксиредоксины. [3]. Особый интерес представляет Prx6, так как который способен восстанавливать широкий спектр пероксидов, включая H₂O₂, небольшие органические гидропероксиды такие как гидропероксид трет-бутила и гидропероксид кумена, гидропероксиды жирных кислот и гидропероксиды фосфолипидов. При этом Prx 6 способен восстанавливать как свободные молекулы гидропероксидов жирных кислот, так и в составе фосфолипидов [4].

 В последнее десятилетие возросло количество исследований, в которых показано, что эндогенный Prx 6 обнаружен во многих тканях [5,6] и функционирует в организме как мощный антиоксидантный фермент [7,8,9], а применение экзогенного Prx 6 успешно используется для повышения антиоксидантного статуса в ткани при различных свободнорадикальных патологиях [10,11,12,13,14,15]. В нашей лаборатории локализация эндогенного Prx 6 была описана в цитоплазме эпителиальных клеток верхних дыхательных путей и легких крысы, в обонятельном эпителии и эпидермисе кожи [6]; в тонком кишечнике крысы [10].

Терапевтическая активность экзогенного Prx 6 была продемонстрирована в нашей лаборатории при лечении резаных ран у крыс [11], после термических [12] и химических [13] ожогов верхних дыхательных путей. Показан защитный эффект экзогенного Prx 6 при повреждении тонкого кишечника, на фоне острой странгуляционной непроходимости [14], при тотальном ишемически/реперфузионнном поражении кишечника [10] и почек [15].

В настоящей работе исследовалась возможность проникновения в ткани экзогенного белка Prx 6 и его распределению, при разных способах введения белка в организм: внутривенное введение, перфузия растворами, содержащими Prx 6 и непосредственная инъекция белка в ткань. Результаты работы позволять выявить способность экзогенного Prx 6 сорбироваться клетками и определить сайты его локализации в тканях. Полученные результаты будут иметь важное значение для дальнейшего выбора способа применения экзогенного Prx 6 при различных свободно-радикальных патологиях и могут быть распространены на другие типы препаратов белковой природы.

Материалы и методы. В экспериментах были использованы крысы-самцы линии Wistar. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для эксперимента и других научных целей» и законодательством Российской Федерации. Всем животным вводился рекомбинантный человеческий Prx 6, который был получен в лаборатории Механизмов рецепции Института биофизики клетки РАН, г. Пущино. Белок содержал на карбоксильном конце 6 остатков гистидина (His-tag). Наличие His-tag домена в экзогенном Prx 6 полностью исключает идентификацию эндогенного Prx 6. Использовалось несколько способов введения: 1. Ретроградная перфузия изолированного сердца крысы средами, содержащими Prx6-His-tag (0,5 mg/ml); 2. Инъекция Prx6-His-tag (2mg/ml) в кожу крысы (межлопаточная область); 3. Внутривенное введение раствора Prx6-His-tag. Для выявления распределения экзогенного Prx6-His-tag в тканях использовались антитела против His-tag домена (1:100) (USBiological, USA), что полностью исключает детекцию распределения эндогенного Prx 6, который не имеет His-tag домена. Микроскопический анализ проводили на микроскопе Leica DM 6000.

Результаты.

1. Распределение экзогенного Prx6-His-tag в тканях сердца при ретроградной реперфузии раствором Prx6-His-tag.

Рис. 1 - Идентификация экзогенного Prx6-His-tag в сердце крысы.

Иммуногистохимический анализ распределения экзогенного Prx6-His-tag в структурах сердца показал, что Prx 6 располагается в стенке кровеносных сосудов соединительной ткани желудочков сердца (рис 1, показано стрелками). Следует отметить, что в сердце уже был идентифицирован Prx 6, который имел эндогенное происхождение и подобную локализацию.

2. Распределение экзогенного Prx6-His-tag в коже, при инъекции раствора Prx6-His-tag в кожу в межлопаточной области крысы.

Рис. 2 - Идентификация экзогенного Prx6-His-tag в коже крысы.

Ранее высокое содержание Prx 6 было обнаружено в эпидермисе кожи [6]. Для выявления мест распределения экзогенного Prx6-His-tag в коже, было проведено иммунногистохимическое окрашивание ткани антителами к His-tag домену экзогенного Prx 6. На рис. 2 видно, что Prx6-His-tag локализуется в гранулярном слое кожи, а так же концентрируется в железах волосяных фолликул (показано стрелками).

3. Распределение экзогенного Prx6-His-tag в тканях внутренних органов при внутривенном введении (в/в) раствора Prx6-His-tag.

С целью определения того, как в/в экзогенный Prx6-His-tag распределяется по органам с током крови, было проведено исследование по детекции его локализации в тканях легкого, кишечника и почек.

3А. Распределение Prx6-His-tag в тканях легкого.

Рис. 3А - Идентификация экзогенного Prx6-His-tag в легких крысы.

Было показано, что при в/в Prx6-His-tag достигает легких с током крови, проникает через оболочки кровеносных сосудов и локализуется в наружной оболочке сосудов, которая примыкает непосредственно к клеткам альвеол (рис 3А, показано стрелками). В структурах легких эндогенный Prx 6 является мажорным среди водорастворимых белков слизи [7].

3Б Распределение Prx6-His-tag в тканях кишечника.

Рис. 3Б - Идентификация экзогенного Prx6-His-tag в тонком кишечнике крысы.

На рис. 3Б представлены данные иммуногистохимического анализа, отражающие локализацию экзогенного Prx6-His-tag в структурах кишечника при в/в раствора белка. Экзогенный Prx6-His-tag достигает кишечника с током крови, выявляется в кровеносных сосудах подслизистой основы и собственной пластинки слизистой оболочки (показано стрелками). Кроме того, отмечается его диффузное распространение по слизистой оболочке кишечника. В кишечнике описан пул эндогенного Prx 6 [5,10].

3В Распределение Prx6-His-tag в тканях почек.

Рис 3В - Идентификация экзогенного Prx6-His-tag почках крысы.

На рис. 3В представлены данные иммуногистохимического анализа, отражающие локализацию экзогенного Prx6 в почках крысы. Было отмечено, что при в/в экзогенный Prx6-His-tag достигает с током крови почек и адсорбируется главным образом в корковом слое органа. В корковом слое почек Prx6-His-tag локализуется преимущественно в почечных клубочках и проксимальных канальцах (показано стрелками). В почках отмечен пул эндогенного Prx 6 [5]

Обсуждение. Свободно-радикальные окислительные процессы являются важным фактором развития ряда патологических состояний [2]. При окислительном стрессе эндогенная антиоксидантная система не в состоянии поддерживать редокс статус в организме, что приводит к тяжелым поражениям. Проблему негативного действия свободно-радикальных процессов можно решить с помощью экзогенных ферментов-антиоксидантов. Как уже отмечалось выше, в этом отношении наиболее перспективными являются антиоксидантные белки с пероксидазной активностью - пероксиредоксины. Протекторный эффект экзогенного Prx6 был подтвержден при лечении резаных ран у крыс [11], после термических [12] и химических [13] ожогов верхних дыхательных путей, при ишемически/реперфузионнном поражении кишечника [10,14] и почек [15].

В настоящей работе мы провели исследование по распределению экзогенного Prx6 в тканях крысы при различных способах его введения в организм. В нашем исследовании мы показали, что экзогенный Prx 6 способен распределяться по тканям и сорбироваться клетками.

Так в сердце после ретроградной перфузии экзогенный Prx 6 был детектирован в желудочках, где он локализуется в наружной стенке кровеносных сосудов, которая примыкает непосредственно к клетках миокарда. Интересно отметить, что локализация экзогенного Prx 6 аналогична локализации эндогенного Prx 6, что должно играть определенную физиологическую роль. В частности, это может говорить о защите наиболее важных и уязвимых мест в миокарде от окислительного стресса.

При инъекции экзогенного Prx 6 в кожу нами была отмечена его локализация в местах скопления эндогенного Prx 6, в гранулярном слое кожи, а также железах волосяных фолликул. Такая локализация может объяснять лечебный эффект от применения экзогенного Prx6-His-tag при поражении кожи [11].

В нашем исследовании мы показали, что при в/в Prx6-His-tag распределяется по органам с током крови и детектируется в тканях легкого, кишечника, почек. Так в легких Prx6-His-tag проникает через оболочки кровеносных сосудов и локализуется в наружной оболочке сосудов, которая примыкает непосредственно к клеткам альвеол. В кишечнике экзогенный Prx6-His-tag детектируется в кровеносных сосудах подслизистой основы и собственной пластинки слизистой оболочки. Кроме того, отмечается его диффузное распространение по слизистой оболочке кишечника. Интересно отметить, что Prx6-His-tag сорбируется именно в тех местах, которые наиболее уязвимы при ишемически/реперфузионном поражении кишечника. Этот факт может объяснять протекторный эффект Prx6-His-tag, который выражается в уменьшении поражения структур кишечника при данной патологии [10,14]. В почках экзогенный Prx6-His-tag сорбируется главным образом в корковом слое органа, где локализуется преимущественно в почечных клубочках и проксимальных канальцах. Таким образом, экзогенный Prx 6 попадают в те места органов, где в случае окислительного стресса наблюдается максимальное разрушение клеток. В частности, в случае почки при ишемически/реперфузионном поражении наблюдается массовая гибель клеток в почечных клубочках и проксимальных канальцах, а применение экзогенного пероксиредоксина практически полностью защищает эти клетки при таком типе поражении органа [15].

Следует особо подчеркнуть, что экзогенный Prx 6 локализуется в тех местах, где наблюдается повышенное содержание эндогенного Prx 6, т.е. осуществляется направленный транспорт белка в эти области. В этом отношении следует отметить, что открытый в нашей лаборатории секреторный белок 45 кДа, являющийся гомологом белков – переносчиков гидрофобных соединений, локализован в тех же местах, что и Prx 6, причем в эквимолярных соотношениях [16]. Функция белка 45 кДа пока не определена, однако внимание привлекает, что возможно данный белок осуществляет транспорт Prx 6 в соответствующее место.

Колоколизация эндогенного и экзогенных ферментов-антиоксидантов Prx 6 в различных тканях свидетельствует о выполнении ими одинаковых функций в организме. Данный факт особенно важен при лечении свободнорадикальных патологий, когда применение экзогенного Prx 6 может быть целенаправленно использовано для повышения антиоксидантного статуса органа. Это альтернатива естественному увеличению уровня эндогенного Prx 6, что является ответной реакцией организма на возросший уровень АФК.

Литература

1. Ланкин В.З. Свободно-радикальные процессы в норме и при патологических состояниях / В.З. Ланкин, А.К. Тихазе, Ю.Н. Беленков. – Москва: РКНПК МЗ РФ, 2001. – 78 с.
2. Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс. Патологические состояния и заболевания / Е.Б. Менщикова, Н.К. Зенков, В.З. Ланкин, И.А. Бондарь, В.А. Труфакин. – Новосибирск: АРТА, 2008. – 284 с.
3. Flohe L., Harris J.R. Peroxiredoxin Systems//Subcellular biochemistry 2007; 44:1-25.
4. Peshenko I.V., Shichi H. Oxidation of active center cysteine of bovine 1-Cys peroxiredoxin to the cysteine sulfenic acid form by peroxide and peroxynitrite//Free Radic. Biol. Med. 2001; 31:292–303.
5. Nan-Nan Liua, Zeng-Shan Liua et al. Full-length cDNA cloning, molecular characterization and differential expression analysis of peroxiredoxin 6 from Ovis aries//Vet. Immunol. Immunopathol. 2015;161:208-219.
6. Novoselov SV, Peshenko IV et al. Localization of the 28-kDa peroxiredoxin in rat epithelial tissues and its antioxidant properties//J. Cell Tissue Res.1999;298:471-480.
7. Power JH, Asad S. et al. Peroxiredoxin 6 in human brain: molecular forms, cellular distribution and association with Alzheimer's disease pathology//Acta Neuropathol.2008;115:611-22.
8. Новоселов В.И. Роль пероксиредоксинов при окислительном стрессе в органах дыхания//Пульманология 2012;1:83-87.
9. Новоселов В.И., Мубаракшина Э.К., Янин В.А. и др. Вклад антиоксидантных систем при регенерации эпителия трахеи после термического ожога верхних дыхательных путей//Пульмонология 2008;6:80–84.
10. Gordeeva AE. Temnov AA. et al. Protective Effect of Peroxiredoxin 6 in Ischemia/reperfusion induced damage of small intestine//Dig.Dis.Sci.2015; DOI 10.1007/s10620-015-3809-3
11. Новоселов В.И., Барышникова Л.М., Амелина С.Е., Фесенко Е.Е. Влияние пероксиредоксина VI на заживление резаной раны//Докл.Акад.Наук 2003;393:412-414.
12. Новоселов В.И., Мубаракшина Э.К., Янин В.А., Амелина С.Е., Фесенко Е.Е. Роль антиоксидантных систем в регенерации эпителия трахеи после термического ожога верхних дыхательных путей// Пульмонология 2008; 6: 81-85.
13. Волкова А.Г. и др. Эффект различных ферментов-антиоксидантов на регенеративные процессы в эпителии трахеи после химического ожога// Пульмонология 2014; 2: 84-91.
14. Гордеева А.Е., Шарапов М.Г., Новоселов В.И. и др. Эффект пероксиредоксина VI на сохранение тонкой кишки крысы при ишемии/реперфузии//Трансплантология 2014;4:21-25.
15. Палутина О.А., Шарапов М.Г. Темнов А.А., Новоселов В.И. Нефропротективный эффект экзогенных ферментов-антиоксидантов при ишемически-реперфузионном повреждении тканей почки//Бюл. эксп. биол. мед. 2015;9:305-310.
16. Merkulova MI, Novoselov VI et al. A novel 45 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium: primary structure and localization//FEBS Lett.1999;450:126-130.

References

1. Lankin VZ Free-radical processes in normal and pathological states / VZ Lankin, AK Tihaze, YN Belenkov. - Moscow: Cardiology Ministry of Health, 2001. - 78.
2. Menshchikova EB Oxidative stress. Pathological conditions and diseases / EB Menshchikova, NK Zenkov, VZ Lankin, IA Cooper, VA Trufakin. - Novosibirsk: ARTA, 2008. - 284 p.
3. Flohe L., Harris J.R. Peroxiredoxin Systems//Subcellular biochemistry 2007; 44:1-25.
4. Peshenko I.V., Shichi H. Oxidation of active center cysteine of bovine 1-Cys peroxiredoxin to the cysteine sulfenic acid form by peroxide and peroxynitrite//Free Radic. Biol. Med. 2001; 31:292–303.
5. Nan-Nan Liua, Zeng-Shan Liua et al. Full-length cDNA cloning, molecular characterization and differential expression analysis of peroxiredoxin 6 from Ovis aries//Vet. Immunol. Immunopathol. 2015;161:208-219.
6. Novoselov SV, Peshenko IV et al. Localization of the 28-kDa peroxiredoxin in rat epithelial tissues and its antioxidant properties//J. Cell Tissue Res.1999;298:471-480.
7. Power JH, Asad S. et al. Peroxiredoxin 6 in human brain: molecular forms, cellular distribution and association with Alzheimer's disease pathology//Acta Neuropathol.2008;115:611-22.
8. Novoselov VI Peroxiredoxins role of oxidative stress in the respiratory // Pulmanologiya 2012; 1: 83-87.
9. Novoselov VI, Mubarakshina EK, Yanin VA and others. The contribution of antioxidant systems in the regeneration of tracheal epithelium after thermal burns of the upper respiratory tract // Pulmonologiya 2008; 6: 80-84.
10. Gordeeva A.E. Temnov A.A. et al. Protective Effect of Peroxiredoxin 6 in Ischemia/reperfusion induced damage of small intestine//Dig.Dis.Sci.2015; DOI 10.1007/s10620-015-3809-3
11. Novoselov VI Baryshnikov LM Amelin SE, Fesenko EE Influence peroxiredoxin VI in the healing of incised wounds // Dokl.Akad.Nauk 2003; 393: 412-414.
12. Novoselov VI, Mubarakshina EK, Yanin VA Amelin SE, Fesenko EE The role of antioxidant systems in the regeneration of the epithelium of the trachea after thermal burns of the upper respiratory tract // Pulmonologiya 2008; 6: 81-85.
13. Volkov AG et al. The effect of various antioxidant enzymes in the regenerative processes in the epithelium of the trachea after chemical burn // Pulmonologiya 2014; 2: 84-91.
14. Gordeeva AE Sharapov MG, Novoselov VI et al. Effect peroxiredoxin VI in preserving rat small intestine ischemia / reperfusion // Transplantologiya 2014; 4: 21-25.
15. Palutina OA, Sharapov MG Temnov AA Novoselov VI Renal protection effect of exogenous antioxidant enzymes during ischemia-reperfusion injury of kidney tissue // Bul. exp. biol. med. 2015; 9: 305-310.17.
16. Merkulova MI, Novoselov VI et al. A novel 45 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium: primary structure and localization//FEBS Lett.1999;450:126-130.