Генотипирование мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF при колоректальном раке методом масс-спектрометрии
Генотипирование мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF при колоректальном раке методом масс-спектрометрии
Аннотация
Колоректальный рак (КРР) представляет собой злокачественное новообразование, развивающееся из эпителия толстой и прямой кишки. В основе патогенеза КРР лежит активация пути рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Активация EGFR приводит к стимуляции роста опухоли, ингибированию апоптоза, сосудистой пролиферации, а также инвазии и метастазированию опухолевых клеток. Сигнальный каскад, инициируемый EGFR, включает малые ГТФазы семейства RAS (HRAS, KRAS и NRAS) и киназы семейства RAF (ARAF, BRAF и CRAF). В настоящее время анализ на наличие мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF включён во все клинические рекомендации по диагностике и лечению КРР. Определение мутационного статуса этих генов позволяет врачам выбрать наиболее эффективные стратегии лечения и повысить качество жизни пациентов.
Цель исследования – апробация мультиплексной панели для выявления мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF с использованием метода масс-спектрометрии на генетическом анализаторе MassArray Analyzer 4. В качестве образцов были использованы – геномная ДНК U-937, не содержащая искомые мутации, в качестве положительных образцов – искусственно синтезированные образцы, содержащие мутации в генах KRAS, NRAS и BRAF, а также образцы ДНК, с известным генотипом, выделенным из опухолевой ткани (FFPE-блоки). С помощью программного обеспечения Assay Design Suite подобраны праймеры и составлена мультиплексная панель, включающая в себя 5 мультиплексов для выявления 84 мутаций. Подготовка аналитов, состоящая из трёх этапов: мультиплексная ПЦР, SAP-реакция и реакция удлинения iPlex, проводилась с помощью набора реагентов "PCR Reagent Set, medium". Для анализа результатов мультиплексного генотипирования, а также для первичной обработки и документирования результатов опыта использовали программное обеспечение "MassArray Typer 4.0". По результатам апробации разработанной мультиплексной панели было выявлено, что аналитическая чувствительность выявления мутантных аллелей составляет 1%, также показано отсутствие неспецифических выходов при анализе геномной ДНК U-937, смешанных контрольных образцов и образцов ДНК, выделенных из FFPE-блоков. Разработанная панель позволяет провести мультиплексное высокоточное генотипирование значимых мутаций в исследуемых образцах методом масс-спектрометрии и подходит для рутинной работы.
1. Введение
Колоректальный рак (КРР) представляет собой злокачественное новообразование, развивающееся из эпителия толстой и прямой кишки , . Согласно оценкам 2022 года, КРР занимает третье место в структуре заболеваемости среди всех видов рака, составляя 9,6% всех новых случаев злокачественных новообразований. Это заболевание также занимает второе место в структуре смертности от рака, на его долю приходится 9,3% всех случаев смерти от онкологических заболеваний .
По данным статистики в России на 2022 год, зарегистрировано примерно 65 000 новых случаев КРР, большинство пациентов с впервые выявленным КРР – люди старше 40 лет. По уровню смертности КРР в России также находится на втором месте среди всех онкологических заболеваний .
В основе патогенеза колоректального рака (КРР) лежит активация пути рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Этот сигнальный путь играет ключевую роль в регуляции различных клеточных процессов, связанных с канцерогенезом. Активация EGFR приводит к стимуляции роста опухоли, ингибированию апоптоза, сосудистой пролиферации, а также инвазии и метастазированию опухолевых клеток.
Сигнальный каскад, инициируемый EGFR, включает малые ГТФазы семейства RAS (HRAS, KRAS и NRAS) и киназы семейства RAF (ARAF, BRAF и CRAF). В этом каскаде белки RAS играют роль молекулярных переключателей, активирующих дальнейшие сигнальные пути, включая киназы RAF, которые, в свою очередь, запускают серию фосфорилирующих реакций, приводящих к изменениям в клеточном ядре и активации генов, связанных с клеточной пролиферацией и выживанием.
Гены KRAS и NRAS играют значительную роль в процессах метастазирования опухоли, и наличие мутаций в этих генах является основным предиктором резистентности опухоли к терапии EGFR-ингибиторами , , . Эти мутации приводят к постоянной активации сигнального пути, минуя регуляцию со стороны EGFR, что делает лечение ингибиторами EGFR неэффективным. При отсутствии мутаций в этих генах терапия EGFR-ингибиторами демонстрирует высокую эффективность, увеличивается средняя продолжительность жизни пациентов, и уменьшается количество рецидивов заболевания , .
Мутации в гене KRAS выявляются в 24-43% случаев КРР, что делает их одними из наиболее частых генетических изменений при этом заболевании . Мутации в гене NRAS при КРР встречаются в 5-10% случаев. Наиболее часто встречающиеся в 3 экзоне (61 кодон), реже во 2 и 4 экзонах (12 и 13, 146 кодоны соответственно) . Мутации в гене BRAF встречаются реже, в 5-20% случаев КРР, однако они также имеют значительное влияние на развитие заболевания. Наиболее часто встречающейся мутацией в гене BRAF является вариант p.V600E, который обнаруживается более чем в 80% случаев мутаций этого гена. Наличие этой мутации значительно снижает ответ опухоли на терапию EGFR-ингибиторами, так как активированная форма белка BRAF ведет к непрерывной передаче сигнала роста и деления клеток, независимо от активности EGFR .
Таким образом, мутации в генах KRAS, NRAS и BRAF являются важными факторами, определяющими биологическое поведение и клинические характеристики КРР, и служат потенциальными мишенями для таргетной терапии .
В настоящее время анализ на наличие мутаций в генах BRAF, NRAS и KRAS включён во все клинические рекомендации по диагностике и лечению КРР. Этот анализ имеет важное значение для определения прогноза течения заболевания и чувствительности опухоли к лекарственным средствам, особенно к терапии EGFR-ингибиторами. Определение мутационного статуса этих генов позволяет врачам выбрать наиболее эффективные стратегии лечения и повысить качество жизни пациентов , .
Для рутинного обнаружения точечных мутаций в генах KRAS и BRAF может быть применен широкий спектр молекулярно-генетических методов: секвенирование по Сэнгеру, массовое параллельное секвенирование, полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием TaqMan-зондов (TaqMan PCR), цифровая ПЦР (ddPCR) и масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией-ионизацией , . Каждый из вышеперечисленных методов имеет свои преимущества и недостатки, в зависимости от индивидуальных пределов обнаружения, трудозатрат, времени выполнения работ, стоимости реагентов и оборудования, а также потенциал для автоматизации и мультиплексирования. Так, например, ПЦР c TaqMan-зондами имеет ограниченную возможность для мультиплексирования и не высокую чувствительность, по сравнению с цифровой ПЦР, которая несмотря на более высокий уровень чувствительности, также имеет ограничения для мультиплексирования. Секвенирование по Сэнгеру также имеет невысокую чувствительность по сравнению с ПЦР, а также низкую пропускную способность. Использование секвенирования нового поколения дает достаточно высокую чувствительность при анализе, но при этом возможны ошибки в процессе подготовки проб и самого процесса секвенирования, кроме того, данный метод достаточно трудозатратен, и требует специальных навыков при работе и анализе полученных данных, кроме того, одним из важных ограничений является высокое качество ДНК , .
Генотипирование с помощью масс-спектрометрии (MALDI TOF) основано на принципе детекции «удлиняющих» праймеров. Пробоподготовка включает в себя несколько этапов: мультиплексная ПЦР-реакция, очистка полученного продукта, ПЦР-реакция «удлинения» праймеров, ионизация и анализ получившихся спектров. Таким образом, при оценке разницы по массе одного нуклеотида в массе «удлиняющих» праймеров определяется соответствующая аллель , . Благодаря высоким мультиплексным возможностям метода обеспечивается высокоточное определение, автоматизация обработки образцов и анализа данных, что необходимо для эффективной интерпретации молекулярных признаков опухоли и улучшения методов персонализированной терапии .
Используя программное обеспечение Assay Design Suite, нами были подобраны праймеры для мультиплексной панели для выявления статуса мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF, которая может использоваться для скрининга пациентов с КРР, что позволит проводить раннюю диагностику и более эффективно подбирать схему таргетного лечения.
Цель исследования – апробирование разработанной мультиплексной панели для выявления мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF с использованием метода масс-спектрометрии на генетическом анализаторе MassArray Analyzer 4.
2. Материалы и методы
2.1. Образцы
В качестве отрицательного контроля использовали геномную ДНК U-937 («СибЭнзайм», Россия), не имеющую мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF.
В качестве положительных контролей использовали искусственно синтезированные образцы, содержащие исследуемые мутации генов KRAS, NRAS и BRAF. Данные генетические конструкции были получены методом сайт-направленного мутагенеза, последовательность конструкций подтверждали секвенированием по Сэнгеру. Для определения относительной чувствительности были приготовлены смешанные контрольные образцы, содержащие 10%, 5%, 1%, 0,5% мутантного аллеля. Концентрация мутантного и нормального аллелей в смеси составляла 5 нг/мкл.
Образцы ДНК, выделенные из опухолевой ткани (злокачественное новообразование кишки) c известным генотипом были получены в РОНЦ им. Н.Н. Блохина (42 образца) для подтверждения специфичности разработанной панели при работе с фрагментированной ДНК.
2.2. Дизайн праймеров
Мутации генов KRAS, NRAS и BRAF были выбраны в соответствии с Клиническим рекомендациями , , список представлен в таблице 1. Всего 84 мутации. С помощью программного обеспечения Assay Design Suite, доступного в онлайн режиме на сайте www.agenabio.com ("Agena Bioscience", США) были сформированы 5 мультиплексов с максимальным числом совместимых SNP. Для каждого SNP было подобрано по два ПЦР-праймера (прямой и обратный) и 1 удлиняющий праймер (UEP) для реакции iPlex. Праймеры были синтезированы в АО «ГенТерра».
Таблица 1 - Список исследуемых мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF
Ген (экзон) | Название | Локация | RS | Ген (экзон) | Название | Локация | RS |
KRAS (2 экзон) | p.G12D | c.35G>A | rs121913529 | NRAS (2 экзон) | p.G12S | c.34G>A | rs121913250 |
p.G12V | c.35G>T | p.G12R | c.34G>C | ||||
p.G12A | c.35G>C | p.G12C | c.34G>T | ||||
p.G12C | c.34G>T | rs121913530 | p.G12D | c.35G>A | rs121913237 | ||
p.G12S | c.34G>A | p.G12A | c.35G>C | ||||
p.G12R | c.34G>C | p.G12V | c.35G>T | ||||
p.G13D | c.38G>A | rs112445441 | p.G13S | c.37G>A | rs121434595 | ||
p.G13V | c.38G>T | p.G13R | c.37G>C | ||||
p.G13A | c.38G>C | p.G13C | c.37G>T | ||||
p.G13C | c.37G>T | rs121913535 | p.G13D | c.38G>A | rs121434596 | ||
p.G13S | c.37G>A | p.G13A | c.38G>C | ||||
p.G13R | c.37G>C | p.G13V | c.38G>T | ||||
p.V14I | c.40G>A | rs104894365 | NRAS (3 экзон) | p.A59T | c.175G>A | rs730880965 | |
KRAS (3 экзон) | p.A59E | c.176C>A | rs104886029 | p.A59S | c.175G>T | ||
p.A59G | c.176C>G | p.A59G | c.176C>G | rs1570874751 | |||
p.A59S | c.175G>T | rs121913528 | p.A59D | c.176C>A | |||
p.A59T | c.175G>A | p.Q61K | c.181C>A | rs121913254 | |||
p.Q61E | c.181C>G | rs121913238 | p.Q61E | c.181C>G | |||
p.Q61K | c.181C>A | p.Q61R | c.182A>G | rs11554290 | |||
p.Q61Hc | c.183A>C | rs17851045 | p.Q61P | c.182A>C | |||
p.Q61Ht | c.183A>T | p.Q61L | c.182A>T | ||||
p.Q61L | c.182A>T | rs121913240 | p.Q61H | c.183A>C | rs121913255 | ||
p.Q61P | c.182A>C | p.Q61H | c.183A>T | ||||
p.Q61R | c.182A>G | NRAS (4 экзон) | p.K117N | c.351G>С | rs376187980 | ||
KRAS (4 экзон) | p.K117Nc | c.351A>C | rs770248150 | p.K117N | c.351G>T | ||
p.K117Nt | c.351A>T | p.K117R | c.350A>G | rs2101739029 | |||
p.K117E | c.349A>G | rs2141506243 | p.K117E | c.349A>G | rs1038226435 | ||
p.K117R | c.350A>G | rs2141506236 | p.A146T | c.436G>A | rs1658995663 | ||
p.A146P | c.436G>C | rs121913527 | p.A146P | c.436G>C | |||
p.A146T | c.436G>A | p.A146V | c.437C>T | rs2101738633 | |||
p.A146V | c.437C>T | rs1057519725 | BRAF (12 экзон) | р.G466E | c.1397G>A | rs121913351 | |
BRAF (16 экзон) | p.V600E | c.1799T>A | rs113488022 | р.G466A | c.1397G>C | ||
p.V600G | c.1799T>G | р.G466V | c.1397G>T | ||||
p.V600Ec | с.1799_1800 TG > AA | р.G469S | c.1405_1406GG>TC | rs1057519720 | |||
p.K601E | c.1801A>G | rs121913364 | р.G469A | c.1406G>C | rs121913355 | ||
p.V600M | c.1798G>A | rs121913378 | р.G469V | c.1406G>T | |||
p.V600Dc | c.1799_1800delinsAC | rs121913377 | р.G469E | c.1406G>A | |||
p.V600R | c.1798_1799delinsAG | р.G469R | c.1405G>C | rs121913357
| |||
p.V600D | c.1799_1800delinsAT | BRAF (16 экзон) | р.L597Q | c.1790T>A | rs121913366
| ||
p.V600K | c.1798_1799delinsAA | rs121913227 | р.L597R | c.1789_1790CT>AG | |||
BRAF (16 экзон) | р.L597S | c.1789_1790CT>TC | rs121913368 | р.T599_V600insTT | c.1797_1797A>TACTACG | rs121913374 | |
р.L597V | c.1789C>G | rs121913369 | р.K601N | c.1803A>T/c.1803A>C | rs121913365 |
2.3. Мультиплексное генотипирование
Подготовку и анализ образцов проводили с помощью комплекта реагентов "PCR Reagent Set, Medium" ("Agena Bioscience", США) согласно инструкции к набору. Мультиплексное генотипирование проводили на автоматизированном генетическом анализаторе MassARRAY Analyzer 4 ("Agena Bioscience", США). Процесс генотипирования состоит из ряда последовательных этапов:
1. Мультиплексная ПЦР;
2. SAP-реакция;
3. iPlex-реакция;
4. Перенос образцов на спектро-чип и ионизация на приборе MassARRAY Analyzer 4;
5. Анализ полученных результатов с помощью программного обеспечения "MassARRAY Typer 4.0".
В ходе 1 этапа (мультиплексная ПЦР) были получены ампликоны, содержащие исследуемые SNP. В качестве образца использовали ДНК-матрицу, с концентрацией 5 нг/мкл. ПЦР проводили в 96-луночных планшетах объёмом 0,2 мл на в амплификаторе "T100 ThermalCycler" ("BioRad", США) согласно следующей программе: первичная денатурация – 95 ºС 5 мин, далее 45 циклов амплификации в условиях: 95 ºС 30 с, 62 ºС 45 с, 72 ºС 60 с, затем инкубировали пробирки при 72 ºС 3 мин.
На 2 этапе (SAP-реакция) происходит дефосфорилирование не включенных в ампликоны дезокситрифосфатов (dNTP) щелочной фосфатазой (SAP, Shrimp alkaline phosphatase). К полученному на 1 этапе ПЦР-продукту добавляли SAP-буфер и SAP Enzyme (0,5 единиц на 1 образец), затем планшет центрифугировали и инкубировали при 37 ºС 40 минут, а затем прогревали при 85 ºС 5 минут.
3 этап – iPlex-реакция (реакция удлинения), в ходе которого происходит удлинение праймеров UEP путём включения модифицированного дидезокситрифосфата (ddNTP) с модифицированной массой, комплементарного нуклеотиду, находящемуся в полиморфной позиции каждого SNP. К очищенному на 2 этапе ПЦР-продукту добавляли смесь удлиняющих праймеров, iPlex-буфер, iPlex-фермент и смесь модифицированных ddNTP. Амплификацию проводили по следующей программе: первичная денатурация – 95 ºС 30 с, далее 40 циклов амплификации в условиях: 95 ºС 5 с, 50 ºС 10 с, 70 ºС 10 с, затем инкубировали пробирки при 72 ºС 3 мин.
К полученному ПЦР-продукту в объёме 9 мкл добавляли 41 мкл стерильной деионизированной воды, затем центрифугировали планшет в течение 1 минуты.
Для переноса образцов на спектро-чип, планшет с ПЦР-продуктом помещали в модуль для подготовки чипов "Chip prep module", в котором проходит очистка аналита с помощью смолы и автоматическое нанесение очищенного аналита на спектро-чип.
После нанесения образцов спектро-чип автоматически переносится в рабочую камеру генетического анализатора MassArray Analyzer 4, где происходит процесс ионизации и получение масс-спектров.
Для анализа масс-спектров в реальном времени, а также для первичной обработки и документирования результатов экспериментов использовали программное обеспечение "MassArray Typer 4.0" ("Agena Bioscience", США).
Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью стандартными методами математической статистики с помощью программы MS Office Excel, результаты определялись статистически значимые при р< 0,05.
3. Результаты и обсуждение
Принцип генотипирования с помощью системы MassArray основан на амплификации ДНК с помощью ПЦР, в результате чего образуются копии как мутантных аллелей, так и нормальных аллелей. В результате iPlex-реакции происходит удлинение пролонгирующего праймера с использованием модифицированных ddNTP – А, C, G, T, каждый из которых имеет разную массу, что приводит к получению ампликонов с разными массами в зависимости от статуса мутации, и впоследствии обнаруживается с помощью масс-спектрометрии.
При наличии в образце ДНК мутации образуется два пика: пик мутантного аллеля и пик аллеля дикого типа. Соотношение площадей под кривой пиков аллели дикого типа и пиков мутантного аллеля является количественной мерой процентного содержания мутантных аллелей.
Для определения специфичности панели были проанализированы отрицательные образцы, представляющие собой разведения геномной ДНК U-937, не содержащей искомые мутации. В результате в исследуемых образцах были получены одиночные пики, по массе соответствующие нормальной аллели. Расчет уровня специфичности был определен путем вычисления отношения интенсивности пиков ПЦР-продукта к неспецифичным пикам с учетом значения соотношения сигнала к шуму (SNR) в 10 контрольных образцах, которое рассчитывается для каждого пика в программном обеспечении "MassArray Typer 4.0". Значения SNR находились в пределах 9,1-35,9, т.е. доля специфичного продукта составляет как минимум 90% для любого из пиков.
Таким образом, все пики, соответствующие аллелям, включенным в панель, определяются однозначно, и специфичность составляет 100%.
Аналитическую чувствительность анализа определяли путем серии экспериментов с использованием контрольных смешанных образцов определенной концентрации мутантного аллеля – 10%, 5%, 1%, 0,5% и оценивали по доле мутантных генотипов (значение call rate). В результате экспериментов нами было определено, что для выявления мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF, концентрация мутантного аллеля в образцах ДНК, должна составлять не менее 1%. Таким образом, выявленная чувствительность выше, по сравнению с исследованием, проведенном Arcilla M., et all (2011), была выявлена чувствительность 5% при обнаружении мутаций BRAF, 2,5% – для мутаций KRAS G12C, G12A, G13C и 10% для мутации KRAS G13D .
Представленная панель была также апробирована на образцах ДНК, выделенных из FFPE-блоков, с известным генотипом. Всего было исследовано 42 образца ДНК. Данные генотипирования, полученные с помощью метода масс-спектрометрии полностью совпали с данными полученными в РОНЦ им. Н.Н. Блохина.
В исследуемых образцах наиболее часто встречающимися мутациями оказались мутации в гене KRAS (76,2%), мутации в гене BRAF были обнаружены в 23,8% случаев, мутации в гене NRAS не были обнаружены, что скорее связано с недостаточной выборкой образцов. Среди мутаций KRAS по частоте выявления преобладала мутация G12D (34,4%), второе место заняла мутация G12V (21,9%), а затем G13D (9,4%). Мутация G12C, с которой ассоциируется развитие лекарственной устойчивости была обнаружена только в 2 случаях (6,2%). Мутации G12R и G12A выявлены в 2 случаях, а мутации 3 (A59T, Q61H, Q61K) и 4 экзонов (A146T, A46P) – по 1 образцу (3,1%). Среди мутаций в гене BRAF преобладала мутация V600E (60%), также были определены мутации V600K и V600M (30% и 10% соответственно). Полученные результаты согласуются с данными, полученными в ходе других исследований , .
Высокий уровень специфичности и чувствительности свидетельствуют о способности разработанной панели строго специфично выявлять анализируемые мутации в мультиплексных реакциях при низких концентрациях мутантного аллеля, в образцах фрагментированной ДНК, а также в присутствии возможных ингибиторов.
Разработанная нами панель имеет ряд существенных отличий от аналогичной панели iPLEX HS Colon Panel ("Agena Bioscience", США»), а именно - оптимальный выбор генов – KRAS, NRAS, BRAF, что соответствует Клиническим рекомендациям , , высокий уровень мультиплексирования – 84 мутации (5 мультиплексов), в отличие от iPLEX HS Colon Panel (5 генов – KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, PIK3CA) и 86 мутаций (из них 77 мутаций, относящихся к генам KRAS, NRAS, BRAF) и 8 мультиплексов соответственно.
4. Заключение
Мутации в генах KRAS, NRAS и BRAF – наиболее значимые прогностические и терапевтические биомаркеры у пациентов с КРР. Оценка мутационного статуса генов KRAS, NRAS и BRAF является обязательной при назначении таргетной терапии, а также для прогнозирования течения заболевания.
Разработанная панель на основе автоматизированного метода MALDI-TOF MS на платформе MassArray позволяет провести одновременное мультиплексное высокоточное количественное генотипирование значимых мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF. Предлагаемая панель позволяет проводить одновременный анализ 84 мутаций в 19 образцах (с использованием 96-луночного планшета) за относительно короткий период времени за одну постановку.
Результаты экспериментов показали высокий уровень специфичности (100 %) и аналитической чувствительности (выявление мутаций при 1% содержании мутантного аллеля в образце ДНК). Апробация на клинических образцах показала хорошие результаты при работе с фрагментированной ДНК, выделенной из FFPE-блоков и отсутствие неспецифических пиков, что говорит о высокой точности используемого метода.
Метод масс-спектрометрии характеризуется высокой степенью автоматизации и подходит для высокопроизводительного анализа большого количества образцов, что делает его пригодным для рутинной работы. Кроме того, MALDI-TOF MS на платформе MassArray представляет собой открытую платформу и позволяет добавлять дополнительные мутации, которые могут быть очень важны в будущем.