ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ ШИПОВНИКА НА МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ

Кузнецова Т.А.¹, Иванченко О.Б.², Калинкин Н.С.³

¹ORCID: 0000-0003-0162-0896, Кандидат биологических наук, ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого», ²ORCID: 0000-0002-1311-1258, Кандидат биологических наук, ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого», ³ORCID: 0000-0003-3394-2152, студент, ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого»

ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ ШИПОВНИКА НА МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ

Аннотация

Проведено морфофизиологическое исследование дрожжевых клеток при влиянии компонентов шиповника, который вносили в питательную среду в составе сиропа шиповника или сока замороженных плодов шиповника морщинистого (Rosa rugosa Thunb.). Изучено влияние компонентов шиповника на интенсивность брожения, почкование, а также на размеры и форму дрожжевых клеток в разных физиологических состояниях. Наибольшее влияние оказывает сок плодов шиповника. Определено влияние исследуемых факторов на форму молодых и материнских клеток. Показано увеличение размеров молодых клеток, имеющих более вытянутую - эллипсовидную  форму.

Ключевые слова: дрожжи, морфологическая характеристика, бродильная активность.

Kuznetsova T.A.¹, Ivanchenko O.B.², Kalinkin N.S.³

¹ORCID: 0000-0003-0162-0896, PhD in Biology, FSAEI “Peter the Great St.Petersburg Polytechnic University”, ²ORCID: 0000-0002-1311-1258, PhD in Biology, FSAEI “Peter the Great St.Petersburg Polytechnic University”, ³ORCID: 0000-0003-3394-2152, Student, FSAEI “Peter the Great St.Petersburg Polytechnic University”

INFLUENCE OF THE ROSE HIPS COMPONENTS ON THE MORPHO-PHYSIOLOGICAL STATE OF YEAST CELLS

Abstract

A morpho-physiological study of yeast cells was carried out with the influence of the rose hips components, which were introduced into the nutrient medium in the composition of rose hips syrup or the juice of frozen fruit of rose hips wrinkled (Rosa rugosa Thunb.). The influence of the rose hip components on the intensity of fermentation, budding, and on the size and shape of yeast cells in different physiological states was studied. The juice of rose hips turned out to be the most influential. The influence of the studied factors on the shape of young and maternal cells is determined. An increase in the size of young cells having a more elongated ellipsoidal shape is shown.

Keywords: yeast, morphological characteristics, fermentation activity.

Введение. В настоящее время в России всё более востребованными становятся продукты питания на основе натурального растительного сырья или обогащенные полезными компонентами. При разработке таких продуктов, большое внимание уделяется доступности растительной добавки. В Северо-Западном регионе роза морщинистая наиболее адаптирована среди различных видов рода Rosa и рекомендуется для выращивания в Санкт-Петербурге и Ленинградской области [1, С. 365]. Плоды R. rugosa богаты не только аскорбиновой кислотой (от 500 до 1352 мг% на сухой вес плодов) и каротиноидами (2,5 мг%), но и другими биоактивными веществами: витамин Р (рутин), В1, К. Кроме того, в плодах содержатся флавоновые гликозиды − кемпферол и кверцетин, сахара – до 18%, дубильные вещества – до 4,5%, пектины – до 3,7%, органические кислоты: лимонная – до 2 %, яблочная – до 1,8% и др.; ликопин, рубиксантин, эфирное масло, значительное количество солей калия и  микроэлементов – железо, марганец, фосфор, кальций, магний. Плоды шиповника обладают фитонцидным и мощным бактерицидным свойством, содержат большое количество антиоксидантов [2, С. 309]. Они служат сырьевой базой для фармацевтической и пищевой промышленности.

Использование сиропов и плодов шиповника в технологии напитков получило широкое распространение. И это связано не только с расширением ассортимента продукции, но, в первую очередь, с их обогащением. Показано, что в концентрациях 20, 25, 35% сироп шиповника не влияет на жизнедеятельность клеток штамма S. cerevisiae, Safale S-04 (Франция), используемых в технологии пивных напитков [3, С. 15]. Данных о влиянии компонентов сиропа или сока плодов шиповника на хлебопекарные дрожжи нами не встречено, вместе с тем, именно хлебопекарные дрожжи чаще всего используются в технологии кваса.

Сегодня на производствах о состоянии дрожжей, используемых в технологическом процессе, судят по количеству живых и мертвых клеток, хотя морфологические показатели играют немаловажную роль в оценке их физиологического состояния [4, С. 98]. Размер, форма дрожжевых клеток имеют свои диапазоны, которые записаны в паспортах штаммов. Однако этот диапазон предполагает варьирование в зависимости от их физиологического состояния и влияния стрессовых факторов. Известно, что под действием стрессовых факторов клетка стремится снизить это воздействие изменением формы – в более округлую [5, С. 35].

Отличительной особенностью популяции растущих дрожжевых клеток является наличие почек. Дочерняя и материнская клетки вскоре после деления могут разойтись, однако, часто еще до их расхождения начинаются новые циклы клеточного деления, в результате чего образуются группы клеток. Размер клеток также зависит от наличия источников углерода и азота в среде, а также от интенсивности аэрации [6, С.13].

Таким образом, целью данной работы являлось изучение морфологического состояния дрожжевых клеток под действием компонентов плодов шиповника, содержащихся в соке замороженных плодов R. rugosa и сиропе шиповника.

Методика. В работе использовали сухие хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae (производство ООО «САФ-НЕВА», г. СПб).

Эффективность процесса брожения определяли по интенсивности образования СО₂ модифицированным экспресс-методом [7, С. 26-30]. Определение накопление спирта проводили анализатором «Колос-2», витамина С по ГОСТ 24556-89 [8]. Количество живых и мертвых дрожжевых клеток в 1 см³ суспензии определяли путем окрашивания клеток метиленовым синим и подсчитывания их в камере Горяева [4, С. 100]. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности.

Микрофотографии прижизненных препаратов делали с помощью камеры IS-500 и компьютерной программы MS-Foto. Обработку фотографий, измерения проводили с помощью компьютерной программы Levenhuk. Ранжировали клетки из дрожжевой популяции на: «основные», подвергшиеся репликации (по форме более округлые); «молодые» клетки, которые достигли площади проекции основных, но имели более вытянутую форму; «мертвые», окрашенные метиленовым синим (рис. 1). Дрожжевая клетка имеет эллипсоидную форму. Определяли площадь проекции дрожжевой клетки, ее большую и малую ось с помощью программы Levenhuk в 100-кратной повторности для каждого ранга клеток, вычисляли коэффициент удлиненности:

где a − длина большой оси, b − длина малой оси.  

Рис. 1 − Микроскопическая картина дрожжевых клеток, окрашенных раствором Люголя (а), окрашенных метиленовым синим (б)

Примечание: 1 – мертвая клетка, 2 – молодая клетка, 3 – материнская (основная) дрожжевая клетка

 

Исследовали дрожжевые клетки при сбраживании солодового сусла, полученного из концентрата квасного сусла (контрольный вариант). Опытные варианты отличались внесением в сусло сиропа шиповника или сока замороженных плодов шиповника (табл. 1).

 

Таблица 1 − Состав и кислотность питательных сред

Вариант опыта	Состав питательной среды				рН
	Квасное сусло, мл	Сироп шиповника, г	Сок плодов шиповника, г	Сахароза, г
Контроль	100	0	0	6	4,44
1	80	20	0	0	4,02
2	90	0	10	5,9	4,21

 

В работе использовали коммерческий препарат сиропа шиповника [9]. Сок плодов шиповника получали путем размораживания ягод, их растирания в ступке и фильтрации сока через стерильную марлю. В сусло вводили сахарозу, учитывая содержание сахаров в сиропе и соке шиповника таким образом, чтобы содержание сахаров в питательной среде было одинаковым. Экспериментально определяли содержание аскорбиновой кислоты: в сиропе шиповника 218,24±2,10 мг%, а в соке замороженных плодов R. rugosa − 950,0±85,2 мг%.

Измерение рН сред показало, что значения находятся в пределах оптимальных значений для роста хлебопекарных дрожжей и это не являются для них лимитирующим фактором [10, С. 19]. Различия значений, вероятнее всего, связаны с разным количеством компонентов шиповника (в том числе органических кислот), влияния которых в совокупности на морфологические параметры мы исследовали, поэтому мы не компенсировали различия в значениях активной кислотности. Сбраживание проводили при температуре 32°С в течение 24 ч.

При анализе полученных данных определяли среднее арифметическое значение и доверительный интервал общепринятыми методами [11, С. 14-15].

Результаты и обсуждение. Известно, что чем более вытянута форма клетки, тем больше площадь ее поверхности и тем более высокой бродильной активностью она обладает. Способность менять форму клетки тесно связана с эластичностью клеточной стенки. У молодых клеток она более тонкая и эластичная, а старые клетки обычно характеризуются «репликативным старением», которое сопровождается образованием рубцов на клеточной стенке и ухудшением обмена веществ [12, С. 17].

Так как концентрация дрожжевых клеток в начале брожения была одинакова − 500×10³ клеток на 1 см³ питательной среды, об интенсивности размножения клеток судили по количеству клеток в процессе культивирования. Исходя из полученных результатов видно, что сироп и сок плодов шиповника оказали стимулирующее влияние на размножение клеток, причем в образцах с добавлением сока плодов шиповника, этот эффект более выражен (рис. 2).

 

Рис. 2 – Количество дрожжевых клеток после 24 ч. Культивирования

Примечание: * – доверительный интервал  

Интенсивность синтеза СО₂ в вариантах с добавлением сиропа и сока шиповника увеличивается по сравнению с контролем, в 1,6 и в 2,1 раза, соответственно.

Объемная доля спирта после 24 ч. брожения в опытных образцах имеет тенденцию к увеличению (с соком плодов шиповника − 2,58±0,42%, с сиропом − 1,88±0,40%) по сравнению с контролем (1,77±0,30%), различия в пределах ошибки.

Как показали наши исследования, во всех вариантах опыта накопление спирта способствовало повышению доли мертвых клеток. В контрольном образце количество мертвых клеток возрастало до 23,01±2,24%, в то время как в опытных вариантах это количество составляло 11,83±2,22% (с сиропом шиповника) и 11,16±3,50% (с соком шиповника).

Материнские (основные) клетки в популяции дрожжей по форме и размерам в разных условиях брожения не имели однозначных закономерных изменений. Эти клетки интенсивно окрашивались раствором Люголя, что свидетельствует о накоплении в них гликогена (рис. 1А). Молодые (дочерние) клетки были более удлиненные (рис. 3), раствором Люголя окрашивались слабо (рис. 1 А). Самые удлиненные молодые клетки были в контрольном образце. В образцах с компонентами шиповника они имели тенденцию к уменьшению коэффициента удлиненности (рис. 3).

 

Рис. 3 − Коэффициент удлиненности дрожжевых клеток после 24 ч. культивирования

Примечание: * – доверительный интервал

Кроме этого, нами замечено, что дочерние клетки часто не отделялись от материнской. Площадь проекций таких клеток превышала площадь проекций материнских клеток (рис. 4). Молодые клетки удлиненной формы имели большую площадь поверхности, чем округлые материнские клетки, эта особенность связана с более эластичной и тонкой клеточной стенкой у молодых клеток [5, С. 14-15]. Вероятно, удлиненные клетки обладают большей интенсивностью обмена веществ, а увеличение доли молодых клеток способствовало увеличению интенсивности брожения.

В образцах с компонентами шиповника наблюдалась тенденция к уменьшению коэффициента удлиненности молодых клеток по сравнению с контролем (рис. 3). Предположительно, компоненты шиповника (в том числе витамины как факторы роста) увеличивали скорость клеточного цикла, в таких питательных средах молодые клетки быстрее росли, старели (округлялись). В этих популяциях, в отличие от контрольной, встречались молодые клетки, почкующиеся не успев отделиться от материнской.

Необходимо отметить, что в контроле и опыте с сиропом шиповника площадь проекций молодых клеток не изменялась (рис.4).

Рис. 4 − Площадь проекции дрожжевых клеток после 24 ч. культивирования.

Примечание: * – доверительный интервал  

В образцах же с соком плодов шиповника площадь этих клеток достоверно возрастала, поэтому можно предположить, что биологически активные вещества сока плодов шиповника стимулировали рост молодых дрожжевых клеток.

Вполне закономерно, что на разных этапах брожения молодые клетки изменяли свою форму от удлиненной к более округлой (рис. 5). Вероятно, в образце с соком плодов шиповника этот процесс был более быстрый под действием БАВ, т.е. клеточный цикл происходил за более короткий срок и наблюдалась стимуляция роста клеток.

Рис. 5 − Ранжирование клеток по физиологическому состоянию

 

Вывод. На основании проведенных исследований можно заключить, что компоненты шиповника оказывают стимулирующее влияние на жизнедеятельность клеток дрожжей. Добавка сока шиповника способствовала увеличению площади проекции молодых клеток, их форма становилась более округлой, интенсивность размножения клеток также возрастала. Сок замороженных плодов шиповника R. rugosa (в исследуемой концентрации) имеет большее стимулирующее влияние, чем сироп шиповника. Таким образом, доказано влияние добавок сока плодов R. rugosa (в концентрации 10 г/100 мл сусла) и сиропа шиповника (20 г/100 мл сусла) на процесс брожения, что необходимо учитывать в технологии производства кваса при разработке напитка, обогащенного исследуемыми добавками.

Список литературы / References

1. Капилян А.И. Сезонный ритм развития интродуцированных видов рода Rosa (Rosaceae) в парке Ботанического сада БИН РАН (г. Санкт-Петербург) / А.Н. Капилян // Растительные ресурсы. – 2015. − Т. 51., № 3, − С. 357-365.
2. Резанова Т.А. Адаптация видов рода Rosa L. в условиях Белгородской области / Т.А. Резанова, В.Н. Сорокопудов, Е.Н. Свинарев, М.В. Евтухова, О.А. Сорокопудова, Н.Н. Нетребенко // Фундаментальные исследования. – 2012. − № 11. – С. 309-312.
3. Иванченко О.Б. Применение плодов шиповника в технологии пивных напитков / О.Б. Иванченко, М.М. Данина // Пиво и напитки. 2015− № 2. − С. 12-15.
4. Качмазов К.С. Дрожжи бродильных производств. Практическое руководство / Г.С. Качмазов. – СПб: Лань, 2012. – 224 с.
5. Берри Д. Биология дрожжей: Пер с англ. / Д. Берри. – М.: Мир, 1985. – 96 с.
6. Котенко С.Ц. Ферментативная активность и морфологические особенности дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-503 при культивировании в аэробных и анаэробных условиях / С.Ц. Котенко, Э.А. Исламмагомедова, Э.А. Халилова // Юг России: экология, развитие. − 2010. − №1. – С. 12-16.
7. Давыденко С.Г. Новый экспресс-метод оценки физиологического влияния слабоалкогольных и безалкогольных напитков / С.Г. Давыденко, А.Т. Дедегкаев, Т.В. Меледина // Пиво и напитки. – 2014. − № 5 − С. 58-63.
8. ГОСТ 24556-89. Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения витамина С. – Введ. 1990-01-01. − М: ИПК Издательство стандартов, 2001. – 12 с.
9. ГОСТ 28499-2014. Сиропы. Общие технические условия. − Введ. 2016-01-01. − М: Стандартинформ, 2015. – 6 с.
10. Новаковская С.С. Справочник по производству хлебопекарных дрожжей. − М.: «Пищевая промышленность», 1980. – 378 с.
11. Джермен М. Количественная биология в задачах и примерах / М. Джермен; пер с англ. А.Д. Базыкина. – М.: Вузовская книга, 2012. – 136 с.
12. Бабьева И.П. Биология дрожжей / И.П. Бабьева, И.Ю. Чернов. − М.: Т-во науч. изд. КМК, 2004. − 239 с.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Kapiljan A.I. Sezonnyj ritm razvitija introducirovannyh vidov roda Rosa (Rosaceae) v parke Botanicheskogo sada BIN RAN (g. Sankt-Peterburg) [Seasonal rhythm of the development of introduced species of the genus Rosa (Rosaceae) in the park of the Botanical Garden of the BIN RAS (St. Petersburg)] / A.N. Kapiljan // Rastitel'nye resursy [Vegetable resources]. – 2015. − T. 51, № 3, − Р. 357-365. [in Russian]
2. Rezanova T.A. Adaptacija vidov roda Rosa L. v uslovijah Belgorodskoj oblasti [Adaptation of species of the genus Rosa L. in the conditions of the Belgorod region] / T.A. Rezanova, V.N. Sorokopudov, E.N. Svinarev, M.V. Evtuhova, O.A. Sorokopudova, N.N. Netrebenko // Fundamental'nye issledovanija [Basic research]. – 2012. − № 11. – Р. 309-312. [in Russian]
3. Ivanchenko O.B. Primenenie plodov shipovnika v tehnologii pivnyh napitkov [The use of hips in the technology of beer beverages] / O.B. Ivanchenko, M.M. Danina // Pivo i napitki [Beer and Beverages]. 2015− № 2. − Р. 12-15. [in Russian]
4. Kachmazov K.S. Drozhzhi brodil'nyh proizvodstv. Prakticheskoe rukovodstvo [Yeast fermentation productions. A Practical Guide] / G.S. Kachmazov. – SPb: Lan', 2012. – 224 р. [in Russian]
5. Berri D. Biologija drozhzhej: Per s angl. [Biology of yeast] / D. Berri. – M.: Mir, 1985. – 96 р. [in Russian]
6. Kotenko S.C. Fermentativnaja aktivnost' i morfologicheskie osobennosti drozhzhej Saccharomyces cerevisiae Y-503 pri kul'tivirovanii v ajerojunyh i anajerobnyh uslovijah [Enzymatic activity and morphological features of yeast Saccharomyces cerevisiae Y-503 in cultivation in airborne and anaerobic conditions] / S.C. Kotenko, Je.A. Islammagomedova, Je.A. Halilova // Jug Rossii: jekologija, razvitie [South of Russia: ecology, development] − 2010. − №1. – P. 12-16. [in Russian]
7. Davydenko S.G. Novyj jekspress-metod ocenki fiziologicheskogo vlijanija slaboalkogol'nyh i bezalkogol'nyh napitkov [A new express method for assessing the physiological effects of low-alcohol and non-alcoholic beverages] / S.G. Davydenko, A.T. Dedegkaev, T.V. Meledina // Pivo i napitki [Beer and Beverages] – 2014. − № 5 − P. 58-63. [in Russian]
8. GOST 24556-89. Produkty pererabotki plodov i ovoshhej. Metod opredelenija vitamina S [Products processing fruits and vegetables. Method for the determination of vitamin C] – Vved. 1990-01-01. − M: IPK Izdatel'stvo standartov, 2001. – 12 p. [in Russian]
9. GOST 28499-2014. Siropy. Obshhie tehnicheskie uslovija [Syrups. General specifications]. − Vved. 2016-01-01. − M: Standartinform, 2015. – 6 р. [in Russian]
10. Novakovskaja S.S. Spravochnik po proizvodstvu hlebopekarnyh drozhzhej [Directory for the production of baker's yeast]. − M.: «Pishhevaja promyshlennost'», 1980. – 378 р. [in Russian]
11. Dzhermen M. Kolichestvennaja biologija v zadachah i primerah [Quantitative biology in problems and examples] / M. Dzhermen; per s angl. A.D. Bazykina. – M.: Vuzovskaja kniga, 2012. – 136 р. [in Russian]
12. Bab'eva I.P. Biologija drozhzhej [Biology of yeast] / I.P. Bab'eva, I.Ju. Chernov. − M.: T-vo nauch. izd. KMK, 2004.− 239 p. [in Russian]