ОПТИМИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТУРЫ SCENEDESMUS SP.

Карякин Д.О.¹, Мальцевская Н.В.², Новичева М.В.³, Кулабухов В.Ю.⁴

¹ORCID: 0000-0001-9645-7256, аспирант, ФГБОУ Московский политехнический университет, Москва, ²Кандидат технических наук, ГБПОУ «Воробьевы горы», Москва, ³Научный сотрудник, ФГБУН Институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича РАН, Москва, ⁴Магистр, ФГБОУ Московский политехнический университет, Москва

ОПТИМИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТУРЫ SCENEDESMUS SP.

Аннотация

Исследовано влияние состава питательных сред для культивирования микроводорослей на примере микроводоросли Scenedesmus sp. На примере основных составляющих элементов питательной среды Сетлик показано, что изменение концентрации компонентов позволяет получить более высокие показатели прироста биомассы, чем в контрольном варианте.

Исследуемым параметром являлись концентрации минеральных солей питательной среды Сетлик - KNO₃,  KH₂PO₄, MgSO₄. Показателем оптимизации являлся прирост биомассы микроводорослей Scenedesmus sp.

Для обработки результатов использованы ротатабельные композиционные планы.

Ключевые слова: Scenedesmus sp., оптимизация питательной среды. ротататбельные композиционные планы.

Karyakin D.O.¹, Maltsevskaya N.V.², Novicheva M.V.³, Kulabukhov V.Yu.⁴

¹ORCID: 0000-0001-9645-7256, Postgraduate Student, Moscow State Polytechnical University, Moscow, ²PhD in Engineering, State Budget Professional Educational Institution “Vorobyovy Gory,” Moscow, ³Research Associate, Federal Publicly Funded Institution of Science “Orekhovich Institute of Biomedical Chemistry of the Russian Academy of Medical Sciences”, ⁴Graduate Student, Federal Publicly Funded Institution of Science “Moscow Polytechnic University,” Moscow

OPTIMIZATION OF NUTRIENT SOLUTION FOR SCENEDESMUS SP.

Abstract

The article studies the effect of nutrient solution composition on the cultivation of microalgae on the example of microalgae Scenedesmus sp. Based on the example of the main constituents of the Setlik nutrient solution  elements, it has been shown that a change in the concentration of components allows obtaining higher biomass growth rates than in the control variant.

The parameter under study include the concentrations of mineral salts of the nutrient solution Setlik-KNO₃,  KH₂PO₄, MgSO₄. The increase in the biomass of microalgae Scenedesmus sp. was the main optimization index.

Rotatable compositional plans were used to process the results.

Keywords: Scenedesmus sp., nutrient solution optimization, rotatable compositional plans.

В настоящее время биомасса микроводорослей представляет большой интерес как один из ценных источников возобновляемого сырья для получения различных коммерчески значимых продуктов, используемых в химической, нефтехимической и пищевой промышленностях. Наиболее важным аспектом применения фототрофных микроводорослей является биоутилизация углекислого газа.

Также внимание исследователей все больше привлекают микроводоросли как источник белков, углеводов, жиров, витаминов и других физиологически активных веществ. Особенно большой интерес представляют протококковые водоросли, такие как хлорелла и сценедесмус. Эти водоросли обладают способностью изменять качественное и количественное содержание органических соединений в клетках в зависимости, от условий выращивания, в том числе и общий прирост биомассы. Сценедесмус представляет большой интерес вследствие того, что данный род может выдерживать значительно более высокие концентрации углекислого газа, чем другие микроводоросли, а, следовательно, более перспективный для задач его биоутилизации.

Химический состав интенсивно размножающихся культур сценедесмуса достаточно стабилен. Вместе с тем, обращает на себя внимание чрезвычайно высокая пластичность метаболизма сценедесмуса и его способность радикально менять направленность биосинтеза в зависимости от условий культивирования при различных воздействиях внешних факторов.

Элементы питания — материальная и жизненная основа существования водорослей. При массовом культивировании микроводоросли сценедесмус обычно используются те же соли, что и при выращивании высших растений. Однако протококковые водоросли, в отличие от высших растений, способны расти при различных концентрациях солей в питательном растворе.

Состав питательных сред всегда известен, однако концентрацию её компонентов в ходе эксперимента можно варьировать.

Для культивирования микроводорослей обычно используют минеральные питательные среды. Подбор основных компонентов, которых является достаточно сложным и долгим процессом. Основные компоненты среды – источники углерода, азота, фосфора, серы, микроэлементов, ростовых факторов и витаминов для начала роста биомассы. Но даже когда основной выбор сделан, и уже известен состав среды, важно определить именно соотношение данных элементов. Это соотношение как раз и надо искать при оптимизации состава сред. Математические модели позволяют сократить время и снизить затраты затрачиваемые на подбор оптимального диапазона концентраций компонентов питательной среды, а также повысить качество полученных результатов [1, С.99-103].

Целью данной работы является изучение влияния различных концентраций солей KNO₃, KH₂PO₄, MgSO₄  на рост культуры микроводоросли Scenedesmus sp. на среде Сетлик [3]

Материалы и методы

В качестве объекта исследований (тест-культуры) использовалась культура фототрофных микроводорослей Scenedesmus sp.

Для исследования была выбрана среда Сетлик 2.02 г/л KNO₃, 0.34 г/л KH₂PO₄, 0.99 г/л MgSO₄·7H₂O, 0.0185 г/л Fe-EDTA, 0.01 г/л Ca(NO₃)₂∙4H₂O, 0.00309 г/л H₃BO₃, 0.0012 г/л MnSO₄∙4H₂O, 0.0014 г/л CoSO₄, 0.00124 г/л CuSO₄·5H₂O, 0.00143 г/л ZnSO₄, и 0.00184 г/л (NH₄)₆Mo₇O₂₄∙4H₂O [6, С. 1-16] Варьировали содержание следующих компонентов: KNO₃ (S1)_,  KH₂PO₄ (S2)_,  MgSO₄·7H₂O (S3).

Варьировали значения концентраций компонентов по данным, приведен в таблице 1.

 

Таблица 1 – Варьируемые компоненты, уровни варьирования

Культивирование осуществляли в колбах Эрленмейера (250 мл) с объемом культуральной жидкости 100 мл на многоканальной установке для культивирования микроорганизмов с нижней подсветкой (освещенность -10 клк) в которую входят: культиваторы (колбы); источник освещения – светоизлучающие диоды; шейке. Прирост биомассы определяли по оптической плотности с применением калибровочных графиков.

Прирост биомассы микроводорослей определяли по оптической плотности фотоэлектроколориметрически на ФЭК КФК 2 УХЛ 4.2, длина волны 750 нм.

Стерилизацию среды осуществляли в автоклаве, режим 0,8 ати, 40 минут.

Каждый опыт по культивированию проводили в течение трех недель, при температуре 25° С, освещенность 10 клк, рН среды 7,0 -8,5.

При обработке результатов использовали ротатабельные композиционные планы, позволяющие более точно описать процесс и позволяют наиболее точно приблизиться к оптимальным искомым характеристикам. Результаты опытов подвергали статистической обработке: считали коэффициенты регрессии, а также проверяли его адекватность с использованием критериев Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для оптимизации  питательных сред существуют различные методы  - тотальный перебор на прямоугольной сетке, метод Гаусса-Зейделя, метод Бокса-Уилсона и т.д. Тотальный перебор на прямоугольной сетке требует довольно большого числа экспериментов, соответственно высоких временных и материальных затрат. Метод Гаусса - Зейделя (последовательное изучение каждого фактора) требует поочередного выполнения серий экспериментов, так как изменение «фона» требует анализа результатов каждой серии – требует много времени и достаточно дорог. В методе Бокса-Уилсона планируемые опыты не приводят сразу к «тотальному» опыту.

В настоящей работе использовали метод математического планирования экспериментов – ротатабельные композиционные планы.  Данный метод был выбран, так как  позволяет одновременно изучить действие нескольких факторов и их взаимодействие, а также количественно  оценить степень этого влияния. Также к ядру плана добавляли дополнительные опыты – звездные точки. Для исследования влияния измененной питательной среды на культуру было произведено культивирование микроводорослей.

Ядром плана являются опыты под номером 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8, которые представляют собой ПФЭ (полный факторный эксперимент) вида 2^k

К точкам ПФЭ плана первого порядка были добавлены 2k  звездных точек, расположенных на осях факторного пространства на одинаковых расстояниях от центра плана- звёздное плечо, которое имеет радиус r₃=2^3/4= 1,682. Далее к точкам  ПФЭ первого порядка добавляли несколько параллельных опытов в центре плана, чтобы сравнить показания относительно него (контрольная область).

В таблице 1 в строках с 9 по 14 приведены «звездные» точки, в строках с 15 по 20 – центр плана.

 

Таблица 2 – Схема планирования эксперимента №1 в натуральных величинах и экспериментальные данные выходных параметров (показатели прироста биомассы) в повторностях (опыт 1.1)

 

Показано, что наиболее удачным соотношением концентраций исследуемых компонентов являются среды под номерами 17, 8, 1  (выделены курсивом). Опыты по номером 20 и 18 показали низкие результаты.

После обработки результатов концентраций  были проведены расчеты и подобраны новые концентрации питательных солей (табл. 2, где Si(i) – значения шагов в крутом восхождении), проведен новый опыт по культивированию и получены следующие результаты, представленный в виде диаграммы (табл. 3).

Таблица 3 – Условия и результаты опыта по исследованию рассчитанных оптимальных концентраций (опыт 1.2)

№ опыта	S1	S2	S3	P1	P2	P3
Si0 (контроль)	3,03	0,374	1,287	0,31	0,56	0,725
Si(1)	2,912	0,367	1,259	0,335	0,5	0,7375
Si(2)	2,74	0,360	1,243	0,245	0,65	0,45
Si(3)	2,566	0,354	1,217	0,45	0,72	0,8375
Si(4)	2,391	0,347	1,187	0,545	1	1,4
Si(5)	2,217	0,340	1,155	0,34	0,3	0,6

 

Сравнивая полученные данные оптических плотностей со значениями оптических плотностей в начале опыта можно сделать вывод, что оптимизация питательной среды прошла успешно, так как полученные значения во много раз превышают значения в начале опыта (в таблице значения выделены курсивом).

На основе полученных в первом эксперименте значений оптической плотности (прирост биомассы микроводорослей), была проведена оптимизация значений.

Условия и результаты опыта 2.1 приведены в таблице 4

 

Таблица 4 – Схема планирования эксперимента  в натуральных величинах и экспериментальные данные выходных параметров в повторностях

По итогам второго эксперимента (проведенного по той же схеме, что и описанный выше эксперимент) было получены значения в опыте 2.2 (табл. 5), превышающие предыдущие, что показывает эффективность оптимизации.

 

Таблица 5 – Условия и результаты повторного эксперимента (опыт 2.2)

№ опыта	S1	S2	S3	P1	P2	P3
Si0 (контроль)	3,03	0,374	1,287	1,05	1,2	1,55
Si(1)	2,865	0,3778	1,329	0,8	1,91	3,16
Si(2)	3,177	0,384	1,371	0,57	0,92	1,2
Si(3)	3,016	0,383	1,329	0,45	0,9	1,55
Si(4)	3,03	0,386	1,371	0,8	1,04	1,425
Si(5)	3,231	0,39	1,413	0,585	0,74	0,8

 

По результатам серии экспериментов подтверждена возможность использования ротатабельных композиционных планов для расчета культивирования, установлен оптимальный состав питательной среды Сетлик – (1'). Далее было проведено сравнение прироста биомассы на питательной среде Сетлик с различными модификациями, (рис. 1). Данные сравнения показали эффективность полученной на этапе 2.2 модификации питательной среды Сетлик для процесса накопления биомассы водорослей Scenedesmus sp.

 

Рис. 1 – Сравнительные поэтапные (1.1, 1.2, 2.1, 2.2) показатели результатов культивирования на питательной среде Сетлик с различным составом

 

Сравнивая полученные данные прироста биомассы микроводорослей можно сделать вывод, что оптимизация питательной среды прошла успешно, так как полученные значения во много раз превышают значения в начале опыта.

Выводы

1. Проведен эксперимент, в ходе которого был определен оптимальный состав питательной среды Сетлик для культивирования микроводорослей Scenedesmus sp. При обработке результатов использовали ротатабельные композиционные планы второго порядка, которые позволили более точно описать процесс.
2. Показано, что применение оптимизированной питательной среды увеличивает прирост биомассы в два раза.

Список литературы / References

1. Бирюков В. В. и др. Основы промышленной биотехнологии. – Москва: КолосС, 2004.
2. Музафаров А. М., Таубаев Т. Т. Культивирование и применение микроводорослей //Ташкент: Фан УзССР. – 1984.
3. Об утверждении методических указаний по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения: ПР от 04.08.2009, N 695// 2009.
4. Saikia M. K., Kalita S., Sarma G. C. An experimental investigation on growth stimulation (+) and inhibition (-) of algae (Oscillatoria chlorina and Scenedesmus quadricauda) treated with pulp and paper mill effluents. Int. J. Appl. Biol. and Pharmaceut. Technol., IJABPT, 2 (4), 2011, 87-94.
5. Kaewkannetra P., Enmak P., Chiu T. Y. The effect of CO₂ and salinity on the cultivation of Scenedesmus obliquus for biodiesel production //Biotechnology and bioprocess engineering. – 2012. – Т. 17. – №. – С. 591-597.
6. Hielscher-Michael, C.Griehl, M. Buchholz, H.-U. Demuth, Norbert Arnold, Ludger A. Wessjohann. Natural Products from Microalgae with Potential against Alzheimer’s Disease: Sulfolipids Are Potent Glutaminyl Cyclase Inhibitors. Mar. Drugs 2016, 14(11), 203; doi:10.3390/md14110203.
7. De Morais M. G., Costa J. A. V. Isolation and selection of microalgae from coal fired thermoelectric power plant for biofixation of carbon dioxide //Energy Conversion and Management. – 2007. – Т. 48. – №. 7. – С. 2169-2173.
8. Bonenfant D., Mimeault M., Hausler R. Determination of the structural features of distinct amines important for the absorption of CO2 and regeneration in aqueous solution //Industrial & engineering chemistry research. – 2003. – Т. 42. – №. 14. – С. 3179-3184.
9. Кулабухов В., Карякин Д., Мальцевская Н. Перспективы использования микроводорослей для поглощения СО2 из дымовых газов промышленных предприятий. Экология и промышленность России. 2016;20(9):4-8. DOI:10.18412/1816-0395-2016-9-4-8.
10. Систер В.Г., Иванникова Е.М., Плотников С.П., Чирков В.Г., Росс М.Ю. Использование адаптивных свойств микроводорослей при производстве фитомассы биотопливного назначения. Экология и промышленность России. 2012;(7):18-21. DOI:10.18412/1816-0395-2012-7-18-21

Список литературы на английском языке / References in English

1. Biryukov V. V. i dr. Osnovy promyshlennoy biotekhnologii. [Fundamentals of Industrial Biotechnology] / V. V. Biryukov // – Moskva: KolosS, 2004. [In Russian]
2. Muzafarov A. M., Taubaev T. T. Kul'tivirovanie i primenenie mikrovodorosley [Cultivation and application of microalgae]/A.M. Muzafarov //Tashkent: Fan UzSSR. – 1984. [In Russian]
3. Ob utverzhdenii metodicheskih ukazaniy po razrabotke normativov kachestva vody vodnyh ob"ektov rybohozyaystvennogo znacheniya, v tom chisle normativov predel'no dopustimyh koncentraciy vrednyh veshchestv v vodah vodnyh ob"ektov rybohozyaystvennogo znacheniya [About approval of methodological guidelines for development of water quality standards for fishery importance water objects, including standards for threshold limit value of harmful substances in the waters of fishery importance water objects] Order of Rosrybolovstvo from 04.08.2009, N 695// 2009.
4. Saikia M. K., Kalita S., Sarma G. C. An experimental investigation on growth stimulation (+) and inhibition (-) of algae (Oscillatoria chlorina and Scenedesmus quadricauda) treated with pulp and paper mill effluents. Int. J. Appl. Biol. and Pharmaceut. Technol., IJABPT, 2 (4), 2011, P. 87-94.
5. Kaewkannetra P., Enmak P., Chiu T. Y. The effect of CO₂ and salinity on the cultivation of Scenedesmus obliquus for biodiesel production //Biotechnology and bioprocess engineering. – 2012. – Т. 17. – №. 3. – P. 591-597.
6. S. Hielscher-Michael, C.Griehl, M. Buchholz, H.-U. Demuth, Norbert Arnold, Ludger A. Wessjohann. Natural Products from Microalgae with Potential against Alzheimer’s Disease: Sulfolipids Are Potent Glutaminyl Cyclase Inhibitors. Mar. Drugs 2016, 14(11), 203; doi:10.3390/md14110203.
7. De Morais M. G., Costa J. A. V. Isolation and selection of microalgae from coal fired thermoelectric power plant for biofixation of carbon dioxide //Energy Conversion and Management. – 2007. – Т. 48. – №. 7. – P. 2169-2173.
8. Bonenfant D., Mimeault M., Hausler R. Determination of the structural features of distinct amines important for the absorption of CO2 and regeneration in aqueous solution //Industrial & engineering chemistry research. – 2003. – Т. 42. – №. 14. – P. 3179-3184.
9. Kulabukhov V., Karyakin D., Mal'tsevckaya N. Perspektivy ispol'zovaniya mikrovodorosley dlya pogloshcheniya CO2 iz dymovyh gazov promyshlennyh predpriyatiy [Prospects for the Use of Microalgae to Absorb CO2 from the Flue Gases of Industrial Enterprises]. Ekologiya i promyshlennost' Rossii [Ecology and Industry of Russia]. 2016;20(9):4-8. DOI:10.18412/1816-0395-2016-9-4-8. [In Russian]
10. Sister V.G., Ivannikova E.M., Plotnikov S.P., Chirkov V.G., Ross M.Y. Ispol'zovanie adaptivnyh svoystv mikrovodorosley pri proizvodstve fitomassy biotoplivnogo naznacheniya [Using the Adaptive Properties of Microalgae in Production of Bio-Fuel-Destination Phytomass]. Ekologiya i promyshlennost' Rossii [Ecology and Industry of Russia]. 2012;(7):18-21. DOI:10.18412/1816-0395-2012-7-18-21. [In Russian]