Характеристика плоидного статуса эмбрионов с различной морфокинетической оценкой по шкале KIDScore D5 у женщин оптимального и старшего репродуктивного возраста
Характеристика плоидного статуса эмбрионов с различной морфокинетической оценкой по шкале KIDScore D5 у женщин оптимального и старшего репродуктивного возраста
Аннотация
Цель исследования – у женщин оптимального и старшего репродуктивного возраста уточнить плоидный статус получаемых эмбрионов с различной (низкой, средней и высокой) морфокинетической оценкой по шкале KIDScore D5, версия 4.
Материал и методы: исследован плоидный статус 634 бластоцист с применением преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидиию (ПГТ-А) на диагностической платформе секвенирования нового поколения – Next Generation Sequencing (NGS). Из указанного числа тестированных бластоцист 258 были получены от женщин < 36 лет и 376 – от женщин ≥ 36 лет. У этих же бластоцист оценивали морфокинетические параметры, которые представляли в виде итоговой суммы баллов, рассчитанных по шкале KIDScore D5, версия 4. Сумма баллов по данной шкале в интервале от 1 до 4,0, от 4,1 до 7,0 и от 7,1 до 9,9 трактовалась, соответственно, как низкая, средняя и высокая.
Результаты: у женщин старше 36 лет в сравнении с более молодыми пациентками отмечалась вдвое большая частота эмбрионов с низкой суммой баллов по шкале KIDScore D5 (KS5) (26,1% против 14,3%, р<0,001) и одновременно вдвое меньшая частота эмбрионов с высокой оценкой их морфокинетических параметров (23,1% против 41,9%, р<0,001). Среди бластоцист, полученных от пациенток младше и старше 36 лет, частота анеэуплоидных эмбрионов в когортах с низкой, средней и высокой оценкой по шкале KS5 составила, соответственно, 70,2% против 80,1% (р<0,001); 51,8% против 66,1% (р<0,001) и 36,4% против 69,2% (р<0,001).
Выводы: результаты ПГТ-А и морфокинетической оценки эмбриогенеза по шкале KS5 при характеристике плоидного статуса тестируемых бластоцист часто не совпадают, в особенности при уточнении качества эмбрионов у пациенток старше 36 лет. При исследовании бластоцист, полученных от женщин в старшем репродуктивном возрасте, представляется оправданным первоочередное назначение ПГТ-А для выбраковки анеуплоидных эмбрионов независимо от результатов оценки их морфокинетических параметров.
1. Введение
Известно, что при выполнении программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) хромосомные аномалии в получаемых эмбрионах не только снижают вероятность их успешной имплантации, уменьшая показатель частоты наступления беременности, но и обусловливают от одной трети до половины всех случаев ранних репродуктивных потерь и почти каждый десятый случай мертворождений
, . Частота анеуплоидии среди эмбрионов, полученных от женщин младше 35 лет, составляет примерно 30%, причем с последующим увеличением возраста доля анеуплодидных эмбрионов прогрессивно нарастает и достигает 80% при использовании ооцитов от пациенток старше 42 лет . Преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А) с использованием современных диагностических платформ, таких как секвенирование нового поколения (Next Generation Sequencing – NGS), позволяет достаточно надежно идентифицировать анеуплоидные эмбрионы и, соответственно, осуществлять их выбраковку, что теоретически служит улучшению исходов вспомогательных репродуктивных технологий , . Однако приходится учитывать, что методика ПГТ-А является весьма затратной диагностической процедурой. К тому же назначение молекулярно-генетического исследования вынуждает отказываться от переноса тестируемых эмбрионов в свежих циклах, что еще больше удорожает лечение из-за необходимости использования криотехнологий для сохранения генетического материала. По этим причинам уточнение наличия хромосомных аномалий эмбрионов проводится сегодня относительно редко, что можно видеть из последних отчетных данных Российской ассоциации репродукции человека (РАРЧ), согласно которым в 2021 году в России доля циклов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с применением всех существующих технических вариантов ПГТ составила всего лишь 10,4% . Очевидно, что высокая стоимость методики ПГТ-А и неудобства, связанные с ее применением, означают невозможность её практического использования в скрининговой манере , . Поэтому необходимо продолжать поиск дополнительных критериев, которые могли бы уточнить ситуации, при которых польза от выполнения ПГТ-А перевешивала бы недостатки этой методологии и аргументировала целесообразность ее обязательного назначения. Кроме того, важно продолжать разработку менее затратных (в сравнении со стоимостью ПГТ-А) методов, которые бы позволяли, хоть и косвенно, но при этом достаточно точно, судить о плоидном статусе эмбрионов и таким образом избавляли от необходимости назначения ПГТ-А.В последние годы в практике эмбриологических лабораторий все более широкое распространение находят клеточные инкубаторы, в которых используется time-lapse технология (TLT) непрерывной видеорегистрации эмбриогенеза. Применение TLT предоставило возможность добавить большой массив морфокинетических показателей к традиционным дискретным морфологическим критериям качества эмбрионов
, , . В настоящее время осуществляется разработка алгоритмов, обеспечивающих оценку качества инкубируемых эмбрионов на основе анализа связи с имплантацией достаточно большого числа морфокинетических параметров. Такие алгоритмы предусматривают использование шкал, применение которых позволяет представлять итоговую морфокинетическую характеристику исследуемых эмбрионов в баллах . Так, шкала KIDScore D5 (сокращенно KS5) в программном обеспечении TLT-инкубатора EmbrioSkope+ делает возможным идентифицию эмбрионов с различным прогнозом успешной имплантации, который зависит от суммы выставленных баллов. Считается, что более высокая сумма баллов при морфокинетической оценке развивающегося эмбриона ассоциируется с большей вероятностью его успешной имплантации , . С учетом этой закономерности проводимая оценка морфокинетических параметров по шкале KS5 позволяет отбирать для переноса/криоконсервации наилучшие из эмбрионов, т.е. те из них, которые обладают наибольшей суммой баллов .Представленный материал убеждает в том, что успешность имплантации определяется как плоидным статусом используемых эмбрионов (оцениваемом с помощью ПГТ-А), так и их морфокинетической характеристикой (отображаемой суммой баллов по шкале KS5). Данное обстоятельство делает актуальным уточнение связи между двумя указанными диагностическими платформами, прогнозирующими исходы программ ЭКО
, , , . Очевидно, что при сопоставлении результатов тестирования одних и тех же эмбрионов с помощью сравниваемых методов можно будет составить более четкое представление о том, возможно ли при суждении о плоидном статусе полученных бластоцист компенсировать неиспользование дорогостоящей инвазивной методики ПГТ-А учетом морфокинетических параметров по шкале KS5. Очевидно, что при ответе на поставленный вопрос должен приниматься во внимание возраст обследуемых женщин, поскольку известно, что в позднем репродуктивном периоде увеличивается частота эмбриональной анеуплоидии и ухудшаются многие морфокинетические параметры, характеризующие эмбриогенез.Цель исследования – у женщин оптимального и старшего репродуктивного возраста уточнить плоидный статус получаемых эмбрионов с различной (низкой, средней и высокой) морфокинетической оценкой по шкале KIDScore D5/версия 4.
2. Материалы и методы исследования
С учётом поставленной в работе цели объектом исследования являлись эмбрионы человека, выросшие из зигот до стадии бластоцисты (n=634) в time-lapse инкубаторе EmbrioSkope+ ES-P1 производства Vitrolife и подвергнутые оценке плоидного статуса с применением ПГТ-А методом NGS. Из указанного числа тестированных бластоцист 258 были получены от женщин < 36 лет и 376 – от женщин ≥ 36 лет.
2.1. Выполнение дотрансферного этапа программы ЭКО
Для проведения настоящей работы было отобрано 163 женщины в возрасте от 22 до 43 лет. Из этих пациенток в оптимальном (<36 лет) и позднем (≥36 лет) репродуктивном периоде пребывали, соответственно, 55 и 108 пациенток. Все наблюдавшиеся больные при включении в программу ЭКО прошли обследование в соответствии с рекомендациями, регламентирующими порядок использования вспомогательных репродуктивных технологий в Российской Федерации (Приказ Минздрава РФ от 2020 г №803 «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), противопоказаниях и показаниях к их применению»).
Число циклов стимуляции суперовуляции, в которых были получены бластоцисты для оценки их плоидного статуса, в группах женщин младше и старше 36 лет равнялось, соответственно, 82 и 179. Для индукции фолликулогенеза назначали различные препараты гонадотропинов в рамках либо стандартного длинного протокола с агонистом гонадотропин рилизинг гормоном (ГнРГ), либо короткого протокола с антагонистом ГнРГ. Через 35-36 часов после введения триггера овуляции пунктировали яичники и забирали все яйцеклетки с диаметром >14 мм.
Оплодотворение зрелых ооцитов проводили через 39-41 час после введения триггера методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ). Через 16-18 часов после ИКСИ проводили оценку оплодотворения. Нормально оплодотворенными ооцитами считали зиготы с 2 пронуклеусами (2PN). Период культивирования эмбрионов до стадии бластоцисты составлял 5-6 суток.
2.2. Оценка плоидного статуса исследуемых эмбрионов
Иссечение блестящей оболочки эмбрионов проводили на 4-е сутки культивирования при помощи лазерной системы OCTAX NaviLase производства Vitrolife. Оценку качества сформировавшихся бластоцист осуществляли на 5-6 день развития эмбрионов с использованием морфологических критериев Д. Гарднера
. Бластоциты хорошего качества (2ВВ-6АА) отбирали для последующего выполнения биопсии клеток трофэктодермы и проведения ПГТ-А. При осуществлении биопсии отделяли 4-10 клеток трофэктодермы. Биоптат переносили в индивидуальные пробирки типа Эппендорф, содержащие 2,5 мл. лизирующего буфера. Пробирки замораживали и передавали в генетическую лабораторию для проведения преимплантационного генетического тестирования методом NGS.При оценке результатов ПГТ-А в соответствии с рекомендациями Международного общества преимплантационной генетической диагностики – Preimplantation Genetic Diagnosis International Society (PGDIS)
к эуплоидным (пригодным для переноса/криоконсервации) эмбрионам относили:- эмбрионы, не имеющие аномальных клеток в тестируемых биоптатах;
- эмбрионы со степенью мозаицизма среди анализируемых клеток трофоэктодермы не более 20%.
2.3. Оценка морфокинетических параметров культивируемых эмбрионов
У всех бластоцист, подвергнутых тестированию с применением ПГТ-А, определяли морфокинетические параметры эмбрионального развития с применением шкалы KIDScore D5, версия 4. Поскольку по указанной шкале присвоенная эмбриону сумма баллов может варьировать от 1 до 9,9, исследованные бластоцисты были распределены на три группы:
- бластоцисты с низкой суммой баллов (от 1 до 4,0);
- бластоцисты со средней суммой баллов (от 4,1 до 7,0);
- бластоцисты с высокой суммой баллов (от 7,1 до 9,9).
Полученные результаты обрабатывали с помощью методов вариационной статистики, применяя компьютерную программу SPSS Statistics 22 (США). При парных сравнениях частот анализируемых показателей выявленные различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.
3. Основные результаты
Анализ распределения полученных бластоцист с учетом их бальной характеристики по шкале KS5 показал, что у женщин старше 36 лет в сравнении с более молодыми пациентками отмечалась вдвое большая частота эмбрионов с низкой суммой баллов (26,1% против 14,3%, р<0,001) и одновременно вдвое меньшая частота эмбрионов с высокой оценкой их морфокинетических параметров (23,1% против 41,9%, р<0,001) (рис.1). Доли генерированных бластоцист со средней суммой баллов по шкале KS5 в когортах эмбрионов, полученных от женщин младше и старше 36 лет оказались практически одинаковыми – 43,9% против 50,8%, р=0,083.
Рисунок 1 - Распределение полученных бластоцист с учетом балльной оценки их морфокинетических параметров по шкале KIDScore D5 и возраста обследованных женщин
Среди бластоцист, полученных от пациенток младше и старше 36 лет, частота анеэуплоидных эмбрионов в когортах с низкой, средней и высокой оценкой по шкале KS5 составила, соответственно, 70,2% против 80,1% (р<0,001); 51,8% против 66,1% (р<0,001) и 36,4% против 69,2% (р<0,001) (рис.2). Из полученных результатов следует, что частота эмбриональной анеуплоидии нарастает при ухудшении морфокинетических параметров развивающихся эмбрионов во всех возрастных группах, однако у женщин старше 36 лет это явление проявляет себя более контрастно.
Рисунок 2 - Частота эмбриональной анеуплоидии среди бластоцист с различной суммой баллов по шкале KIDScore D5 у женщин в оптимальном и старшем репродуктивном возрасте
Заслуживает внимания, что даже среди бластоцист с высокой суммой баллов по шкале KS5 обнаруживалась достаточно большая частота анеуплоидных эмбрионов, которая у пациенток старше 36 лет достигала 69,2%, а у более молодых женщин – 36,4%.
4. Обсуждение
Выполненное исследование наглядно продемонстрировало, что поздний репродуктивный возраст является фактором, заметно ухудшающим морфокинетические параметры эмбриогенеза, характеризуемые на основе их бальной оценки по шкале KS5. У женщин старше 36 лет это проявляется в перераспределении получаемых бластоцист в сторону почти двукратного возрастания доли эмбрионов с низкой (от 1 до 4,0) суммой баллов по шкале KS5. Причем увеличение относительного числа бластоцист с низкой морфокинетической оценкой сопровождается параллельным и весьма существенным сокращением доли эмбрионов с высокой (от 7,1 до 9,9) суммой баллов по шкале KS5.
Следует подчеркнуть, что исследованные нами бластоцисты, различавшиеся по сумме присвоенных им баллов по шкале KS5, по гарднеровским критериям характеризовались «хорошим» качеством, т.е. обладали параметрами на уровне 2ВВ-6АА. Это наблюдение подтверждает высказываемое многими авторами , , положение о том, что при отборе бластоцист для переноса/криоконсервации полезно принимать во внимание не только традиционные гарднеровские критерии их качества, но и морфокинетические параметры. Весьма вероятно, что одна из причин наблюдаемого ухудшения репродуктивных исходов при использовании программ ЭКО у пациенток старшего репродуктивного возраста объясняется тем, что для практического использования могут отбираться эмбрионы с ненадлежащей морфокинетикой. Очевидно, что для предупреждения такой ситуации целесообразно использовать для клеточного культивирования инкубаторы типа EmbrioSkope+, оснащенные системой time-lapse. При этом необходимо применять оценочные алгоритмы, позволяющие ранжировать исследуемые эмбрионы с учетом их морфокинетических характеристик, отображаемых в баллах, подобно тому, как это предусматривается при использовании шкалы KS5. Согласно сообщениям многих авторов , , , для улучшения результатов ЭКО (частоты имплантации и частоты родов) представляется оправданным отдавать приоритет при отборе эмбрионов со сходной морфологией тем их них, которые получают более высокую морфокинетическую оценку.
Помимо морфокинетических характеристик, для реализации репродуктивного потенциала эмбрионов большое значение имеет их плоидный статус. Многими исследователями в прошлом было показано, что в структуре причинных факторов, ответственных за неудачи в циклах ЭКО, значительная доля приходится именно на эмбриональную анеуплоидию , . Применение ПГТ-А способно решить проблему отбора эуплоидных эмбрионов, однако, ограничения в использовании молекулярно-генетической диагностики (связанные с ее дороговизной и необходимостью отказа от переноса эмбрионов в свежих циклах) делает актуальным поиск менее затратных и более удобных методов, коррелирующих с результатами ПГТ-А. Высказывается предположение, что при учете морфокинетических характеристик (при использовании инкубаторов с time-lapse системой видеорегистрации эмбриогенеза) можно будет составлять довольно точное представление о плоидном статусе развивающихся эмбрионов , , , , что будет освобождать от необходимости выполнения дорогостоящей процедуры ПГТ-А. Проведенная в нашей работе проверка этого предположения показала, что корреляция между морфокинетикой и плоидным статусом эмбрионов действительно существует, что проявляется в более высокой частоте эмбриональной анеуплодии среди бластоцист с низкой оценкой по шкале KS5. Данная закономерность отмечалась в одинаковой степени в когортах бластоцист, полученных от женщин в оптимальном и старшем репродуктивном возрасте. Тем не менее приходится констатировать, что среди бластоцист с высокой суммой баллов по шкале KS5 всё же присутствовали анеуплоидные эмбрионы в достаточно большом количестве, причем особенно высокой была их доля в когорте бластоцист, полученных от женщин старше 36 лет.
Обнаруженный нами факт присутствия большого числа анеуплоидных эмбрионов среди бластоцист с высокой оценкой их морфокинетических параметров означает, что возможные заключения об отсутствии нарушений в плоидном статусе эмбрионов, опирающиеся только на анализ морфокинетики (по шкале KS5) и не предусматривающие выполнение ПГТ-А, часто будут не соответствовать истине. Это обстоятельство указывает на явную несостоятельность идеи использования морфокинетической оценки эмбриогенеза по шкале KS5 для суждений о плоидном статусе эмбрионов в качестве альтернативы ПГТ-А, в особенности при ведении пациенток старшего репродуктивного возраста.
Таким образом, полученный нами материал показывает, что при оценке плоидного статуса эмбрионов результаты морфокинетического тестирования и ПГТ-А хотя и коррелируют, однако оказываются достаточно далекими от полного совпадения, что подтверждает сообщения других авторов , которые также отмечали высокий процент эмбриональной анеуплоидии среди бластоцист с высокой морфокинетической оценкой особенно в старшем репродуктивном возрасте По этой причине морфокинетическую оценку эмбриогенеза, основанную на критериях, учитываемых шкалой KS5, вряд ли можно рассматривать как оправданную альтернативу ПГТ-А, если ставится задача надежной выбраковки анеуплоидных эмбрионов.
5. Заключение
Результаты ПГТ-А и морфокинетической оценки эмбриогенеза по шкале KS5 при характеристике плоидного статуса тестируемых бластоцист хотя и коррелируют, однако часто не совпадают, в особенности при уточнении качества эмбрионов у пациенток старше 36 лет.
При исследовании бластоцист, полученных от женщин в старшем репродуктивном возрасте, представляется оправданным приоритетное назначение ПГТ-А для выбраковки анеуплоидных эмбрионов независимо от результатов оценки их морфокинетических параметров, что подразумевает целесообразность молекулярно-генетического тестирования на хромосомные аномалии даже бластоцист с очень высокой оценкой их морфокинетики.
У женщин младше 36 лет для суждений о плоидном статусе эмбрионов при невозможности выполнения ПГТ-А допустимо ограничиться учетом морфокинетических параметров, хотя и в этом случае надежность выбраковки анеуплоидных эмбрионов не будет соответствовать идеалу, т.е. не обеспечит тех результатов, которые могут быть достигнуты с помощью ПГТ-А.
Таким образом, если в рамках протокола ЭКО проводится ПГТ-А, то ключевым фактором принятия решения о пригодности тестируемого эмбриона к переносу/криоконсервации должно быть медико-генетическое заключение, тогда как результаты морфокинетической оценки эмбриогенеза должны приниматься во внимание во вторую очередь.