ОЦЕНКА КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ И ЛИЗОЦИМА
ОЦЕНКА КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ И ЛИЗОЦИМА
Аннотация
В статье представлены результаты оценки сочетанного действия различных концентраций водорастворимых витаминов В1 (тиамина) и С (аскорбиновой кислоты) с лизоцимом в отношении Micrococcus luteus. В работе использован диффузионный метод оценки действия соединений. Показано, что некоторые концентрации тиамина и аскорбиновой кислоты наряду с собственной антимикробной активностью могут усиливать эффект литического действия лизоцима. Обнаруженная синергидная с лизоцимом активность водорастворимых витаминов-антиоксидантов может послужить предметом дальнейшего изучения их применения для борьбы с инфекционными заболеваниями в качестве вспомогательного антибактериального компонента с препаратами, содержащими лизоцим.
1. Введение
Проблема формирования устойчивости микроорганизмов к антибиотикам приобретает все большие масштабы. В связи с этим ведётся разработка новых подходов к лечению и профилактике инфекционных заболеваний. В настоящее время поиск антибактериальных препаратов является актуальной задачей современной медицины во всем мире. Это, безусловно, необходимое, перспективное и, вместе с тем, трудоёмкое и долгосрочное направление. Синтез новых или модифицированных молекул сопровождается существенными финансовыми затратами и не всегда решает проблему. В литературе последних лет все чаще появляются публикации о возможном применении уже известных препаратов для изменения патогенного потенциала или полного подавления микрофлоры при заболеваниях микробного генеза . С этих позиций представляют интерес витамины, в частности витамины С и B1 – сложные химические соединения, значимость которых для организма не вызывает сомнения. Известно, что витамин С (аскорбиновая кислота) способствует повышению устойчивости организма при инфекционных заболеваниях. При С-авитаминозе наблюдается особое предрасположение к любым инфекциям, в частности, к пневмониям, вследствие снижения резистентности организма . Биологическая роль витамина С в основном связана с его участием в реакциях гидроксилирования, где он является донором водорода. Аскорбиновая кислота, или аскорбат, обладает антиоксидантным действием, участвует в биосинтезе специфических соединительнотканных белков: коллагена и эластина, входящих в состав хрящей, костей и стенок сосудов. Сходным действием обладает и тиамин, выступая как антиоксидант, защищая организм от разрушительных воздействий. Известно, что B1-витаминная недостаточность снижает сопротивляемость организма к некоторым хроническим инфекциям. Вместе с тем есть сведения о непосредственном влиянии водорастворимых витаминов на отдельные патогенные, условно-патогенные и пробиотические микроорганизмы . Установлено, что витамины в определенных концентрациях могут стимулировать рост одних и – ингибировать рост других бактерий. Растворы витаминов способны оказывать влияние на резистентность микроорганизмов к антибиотикам . При этом, в литературе недостаточно освещен эффект применения водорастворимых витаминов в сочетании с антимикробными агентами. В частности, известно, что в комплексе с лизоцимом аскорбиновая кислота создает оптимальную кислотность среды, способную разрушить бактериальные клетки , . В клинической практике хорошо зарекомендовали себя в лечении гнойно-воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей комбинированные препараты естественного лизоцима с пиридоксином (витамином В6), и с аскорбиновой кислотой , . В стоматологической практике все чаще внедряют соли аскорбиновой кислоты в различных концентрациях . Успешная практика сочетания различных терапевтических препаратов с витаминами послужила основанием для нашего исследования.
Цель исследования – оценка сочетанного действия лизоцима и различных концентраций водорастворимых витаминов В1 и С на тест-культуру M. luteus.
2. Методы и принципы исследования
Объектом исследования была тест-культура Micrococcus luteus (lysodeikticus) ATCC 4698. Данный микроорганизм был выбран в качестве мишени, учитывая его известную чувствительность к лизоциму. Культивирование микроорганизма проводили на ГРМ-агаре (Оболенск, Россия). В работе использованы витамин В1 (ОАО «Борисовский завод медицинских препаратов», Республика Беларусь), витамин С (Армавирская биологическая фабрика, Россия), яичный лизоцим (Fluka BioChemika, Бельгия). Изучено действие следующих концентраций витамина В1 и витамина С 50 мг/мл, 5 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,005 мг/мл, 0,005 мг/мл. Оценивалась литическая активность лизоцима в концентрациях 175 мг/мл, 87,5 мг/мл, 17,5 мг/мл, 1,75 мг/мл, 0,175 мг/мл. Разведения изучаемых соединений готовили на стерильном растворе 0,9 % NaCl.
Исследование выполнено по методикам , . Лунки в агаре вырезали специальным пробойником диаметром 3 мм. В лунки с помощью дозатора вносили по 50 мкл растворов, используемых в эксперименте (контроль – физиологический раствор, опыт – изучаемые концентрации лизоцима, витамина В1 (тиамина), витамина С (аскорбиновой кислоты), раствор лизоцима с добавлением разных концентраций витамина В1, раствор лизоцима с добавлением разных концентраций витамина С). Чашки инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. При измерении зон задержки роста ориентировались на зону полного подавления видимого роста. Результаты учитывали в мм, по величине диаметра зоны подавления роста микроорганизмов вокруг лунок.
Все эксперименты были выполнены в трех повторах. Статистический анализ проводили с использованием программ Past, Microsoft Exel, Statistica. Данные представлены как среднее ± SD (стандартное отклонение). Значимость различий между контролем и вариантами эксперимента определяли с использованием метода множественных сравнений Даннета. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
3. Основные результаты
Рисунок 1 - Степень литической активности лизоцима против M. luteus
Рисунок 2 - Влияние витаминов на рост M. luteus
Рисунок 3 - Влияние сочетанного действия витаминов и лизоцима на рост M. luteus
4. Обсуждение
Результаты исследования показали, что лизоцим предсказуемо оказывал литическое действие на чувствительную к нему тест-культуру микроорганизмов. Вместе с тем, выяснилось, что и концентрации водорастворимых витаминов В1 и С при разведении на два и даже три порядка оказывают в эксперименте ингибирующее действие на тест-культуру Micrococcus luteus. Обнаруженный антибактериальный эффект витаминов согласуется с известными данными о способности аскорбиновой кислоты (С) и тиамина (B1) задерживать рост грамположительных бактерий, а именно, Staphylococcus aureus , . Совместное использование лизоцима и водорастворимых витаминов B1 и С, оказывало синергидный антибактериальный эффект, причём более наглядно это проявлялось при комбинации лизоцима с тиамином. Обнаруженный факт укладывается в парадигму одной из стратегий усиления антибактериального эффекта уже известных лекарственных средств сочетанием двух и более биологически активных веществ , . Учитывая, что обнаруженный синергидный эффект изучаемые витамины оказывали in vitro в концентрациях, превышающих таковую в организме, перспективным представляется оценить возможность их использования как вспомогательный антибактериальный компонент для наружного применения.
5. Заключение
Проведенные исследования показали возможность расширения использования разных концентраций водорастворимых витаминов B1 и С в сочетании с лизоцимом для эффективной борьбы с бактериальными инфекциями. Это позволяет считать исследование перспективным и даёт основание для проведения дальнейших экспериментов с целью оптимизации схемы практического использования.