ИОНЫ ХЛОРА ОКАЗЫВАЮТ РЕГУЛИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ НА СЫВОРОТОЧНУЮ ГИАЛУРОНИДАЗУ
ИОНЫ ХЛОРА ОКАЗЫВАЮТ РЕГУЛИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ НА СЫВОРОТОЧНУЮ ГИАЛУРОНИДАЗУ
Аннотация
В задачу данного исследования входило выяснение влияния ионов хлора на гиалуронидазную активность сыворотки крови крыс. Ранее нами было показано, что, как хлорид натрия, так и хлорид калия могут оказывать регулирующее влияние на фермент, стимулируя рост гиалуронидазной активности при низких концентрациях и подавляя гиалуронидазную активность при высоких концентрациях. Поскольку данный эффект был характерен для хлоридов натрия и калия представляло интерес выяснить, как влияют соли других галогенов этих катионов на сывороточную гиалуронидазную активность. Было показано, что добавление в среду инкубации фторида натрия или бромида калия не вызывали активирования фермента. Делается вывод, что ионы хлора скорее, чем катионы натрия и калия, способны оказывать влияние на сывороточную гиалуронидазу.
1. Введение
Гиалуроновая кислота (гиалуронан) является гликозаминогликаном, состоящим из многократно повторяющихся дисахаридных звеньев, включающих D-глюкуроновую кислоту и N-ацетил-D-глюкозамин. Размеры этого полимера могут достигать 107 Да , . Являясь основным структурным компонентом межклеточного матрикса, она может находиться как в высокополимерном состоянии, так и в виде фрагментов гораздо меньшего размера. Несмотря на простоту строения, интерес к этой молекуле не только не ослабевает, но все больше возрастает, поскольку, если раньше роль гиалуроновой кислоты сводилась только к гидратации тканей, то исследования последних лет демонстрируют участие этого полимера в целом ряде как физиологических так и патологических процессов, протекающих в человеческом организме. Причем, в зависимости от размера молекулы, влияние может быть противоположным. Так, гиалуронан с высокой молекулярной массой проявляет антиангиогенные и противовоспалительные свойства, в то время как гиалуронан с низкой молекулярной массой, наоборот, обладает ангиогенными и провоспалительными эффектами , .
Фрагментация и деградация гиалуроновой кислоты обеспечивается, в основном, гиалуронидазами 1-го и 2-го типов . Гиалуронидаза 1-го типа была первой соматической гиалуронидазой, выделенной из сыворотки крови в чистом виде и охарактеризованной. Этот фермент активен в кислой среде, поэтому считается лизосомальным , . Несмотря на то, что с тех пор прошло достаточно много времени, до сих пор до конца не ясно, каково значение циркуляции этого фермента с кислым рН-оптимумом в кровеносном русле. Предполагается, что не все ткани, демонстрирующие гиалуронидазную активность, способны синтезировать гиалуронидазу 1-го типа, а могут получать фермент из кровеносного русла в результате эндоцитоза . В этой связи изучение факторов, оказывающих влияние на активность сывороточной гиалуронидазы представляется актуальной задачей.
Ранее нами было показано, что хлорид натрия оказывал существенное влияние на гиалуронидазу, активность которой определяли в сыворотке крови крыс линии Вистар. Было продемонстрировано, что внесение в среду инкубации низких концентраций соли вызывало рост активности фермента, но когда концентрация соли превышала 100 мМ, можно было наблюдать постепенное снижение активности гиалуронидазы в зависимости от концентрации соли. При замене хлорида натрия на хлорид калия динамика изменения сывороточной гиалуронидазной активности была одинаковой . В связи с этим представляло интерес выяснить, будут ли соли других галогенов этих катионов оказывать аналогичное влияние на сывороточную гиалуронидазную активность.
2. Методы и принципы исследования
Эксперименты проводились на самцах белых крыс линии Вистар весом 200-300 г, содержавшихся в условиях вивария. Животных декапитировали, после чего собирали кровь, давали ей свернуться, а затем центрифугировали при 600 g и температуре 40С в течение 5 минут. Сыворотку отбирали и использовали для проведения опытов, или хранили в замороженном при -200С виде до дня применения в экспериментах. Все процедуры, выполненные с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ.
Образцы инкубировали в течение 3 часов при 370С в присутствии гиалуроновой кислоты (0,5 мг/мл), после чего активность гиалуронидазы сыворотки крови определяли при помощи флюориметрического метода Моргана-Эльсона в модификации Такахаши . Длина волны возбуждения – 545 нм, эмиссии - 602 нм (Флюорат – 2М, ЛЮМЭКС, Санкт-Петербург, Россия). Сопутствующую экзогидролазную активность подавляли добавлением в среду инкубации 0.03 М слизевой кислоты. Единицей ферментативной активности считалось то количество фермента, которое при данных условиях реакции приводило к образованию 1 микромоля концевого n-ацетилглюкозамина в течение 1 минуты.
Статистическая оценка достоверности отличий полученных результатов проводилась при помощи t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений. Результаты, представленные в статье являются средними значениями ± ошибка среднего (M±m).
3. Результаты и их обсуждение
Рисунок 1 - Влияние хлорида и фторида натрия на активность гиалуронидазы сыворотки крови крыс линии Вистар
Примечание: звездочкой обозначены достоверные отличия при p < 0,05 по сравнению с контролем на обоих графиках; треугольником обозначены достоверные отличия при p < 0,05 между хлоридом и фторидом натрия в каждой точке; результаты представляют средние значения 6 отдельных экспериментов
Рисунок 2 - Влияние хлорида и бромида калия на активность гиалуронидазы сыворотки крови крыс линии Вистар
Примечание: звездочкой обозначены достоверные отличия при p < 0,05 по сравнению с контролем на обоих графиках; треугольником обозначены достоверные отличия при p < 0,05 между хлоридом и бромидом калия в каждой точке; результаты представляют средние значения 6 отдельных экспериментов
4. Заключение
Ионы хлора необходимы для увеличения активности гиалуронидазы, определяемой в крови крыс линии Вистар. Высокие концентрации хлоридов как натрия, так и калия оказывают гораздо меньший ингибирующий эффект на сывороточную гиалуронидазную активность белых крыс, по сравнению с фторидом натрия и бромидом калия. Разнонаправленное в зависимости от концентрации влияние хлорида натрия на активность гиалуронидазы сыворотки крови, очевидно, связано в большей степени с анионами хлора, чем с катионами натрия.