ОКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА ЦЕРИЯ

Научная статья
DOI:
https://doi.org/10.60797/IRJ.2024.143.176
Выпуск: № 5 (143) S, 2024
Предложена:
27.02.2024
Принята:
22.03.2024
Опубликована:
31.05.2024
318
19
XML
PDF

Аннотация

Наночастицы оксида церия представляют собой перспективный материал для биомедицинского применения благодаря своей способности выполнять функции различных ферментов. В работе продемонстрирована возможность наночастиц имитировать поведение фермента оксидазы. Оксидазная активность наночастиц оксида церия была исследована с использованием буферного раствора и хромогенного субстрата 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ). В ходе работы были количественно оценены параметры ферментативной кинетики для процесса окисления ТМБ под действием наночастиц CeO2, обладающих оксидазной миметической активностью: определены значения максимальной скорости реакции, константы Михаэлиса, каталитической константы. Показано, что оксидазная активность стабилизированных мальтодекстрином наночастиц диоксида церия зависит от водородного показателя среды.

1. Введение

В настоящее время ключевую роль среди наноэнзимов играют наноматериалы на основе диоксида церия. Наночастицы диоксида церия (НДЦ) вызывают большой интерес из-за широкого спектра применения в различных областях, таких как топливные элементы

, датчики газа
, поглотители ультрафиолета
, и биомедицинские приложения
. НДЦ представляют интерес для медицины благодаря своей способности участвовать в процессах окисления-восстановления, обусловленной кислородной нестехиометрией. Именно присущая НДЦ кислородная нестехиометрия, образующаяся при удалении кислорода с поверхности, отвечает за его уникальную биологическую активность.

В зависимости от водородного показателя среды НДЦ проявляют как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства. Уникальность НДЦ заключается в возможности селективного уничтожения опухолевых клеток, которые характеризуются более кислым значением pH по сравнению со здоровыми. С одной стороны, в нейтральной среде наночастицы демонстрируют антиоксидантные свойства, что приводит к уменьшению окислительного стресса. С другой стороны, с уменьшением pH НДЦ наиболее активно проявляют прооксидантные свойства. В этом случае производство АФК увеличивается, а значит, гибель опухолевых клеток происходит эффективнее

.

В литературе большое внимание уделяется исследованию антиоксидантных и прооксидантных свойств наночастиц СеО2, а также изучению его мультиферментативной активности, т.е. способности выполнять функции ферментов супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы и оксидазы

.

Однако в литературе в настоящее время отсутствуют результаты комплексных исследований влияния кислотности среды на оксидазную активность наночастиц оксида церия. Более тщательное изучение этой темы, установление зависимости между этими параметрами позволит использовать НДЦ в качестве терапии для избирательного уничтожения злокачественных образований.

2. Методы и принципы исследования

Наночастицы оксида церия CeO2 в мальтодекстриновой оболочке были получены методом осаждения согласно методике, представленной в работе

. Концентрация приготовленной суспензии наночастиц составила 10 мг/мл. С целью предотвращения образования агломератов частиц приготовленная суспензия подвергалась 30-минутной ультразвуковой обработке в ванне ПСБ-Галс. Для моделирования кислотности среды были приготовлены уксусно-ацетатные растворы трех значений pH: 4,0; 5,0; 6,0. Величина pH растворов контролировалась с помощью лабораторного иономера И-160МИ.

Оксидазная активность наночастиц церия была исследована с использованием буферного раствора и хромогенного субстрата 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ). В работе проведена серия опытов с разными значениями pH среды. Таблица 1 содержит список реагентов с указанием объемов и концентраций.

Таблица 1 - Объемы и концентрации реагентов

Реагент

Буфер, pH=4,0; 5,0; 6,0

НДЦ

ТМБ

Концентрация, мг/мл

-

10

5

Объем, мкл

4000

80

10; 20; 40; 60; 80

Измерения зависимостей оптической плотности растворов от времени были проведены с использованием спектрофотометра ПЭ-5400УФ на длине волны 652 нм в течение 300 секунд. Затем из значений оптической плотности растворов была рассчитана концентрация продукта окисления ТМБ в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера, при этом коэффициент молярного поглощения взят равным 39000 (моль/л)-1см-1

.

Согласно модели Михaэлисa – Ментен, при увеличении концентрации субстрaтa до определенного уровня скорость реакции достигает максимума:

img
(1)

где υ – скорость реакции при определенной концентрации субстрата;

υmax – максимальная скорость ферментативной реакции;

[S] – концентрация субстрата;

KM – константа Михаэлиса.

Путем линеаризации уравнения Михaэлисa – Ментен можно получить уравнение Лайнуивера- Берка (2):

img
(2)

где 1/υmax –пересечение с осью ординат;

KMmax – тангенс угла наклона прямой;

1/ KM –отрезок, отсекаемый на оси абсцисс.

3. Основные результаты и обсуждение

Приготовленные растворы с различными значениями pH: 4,0; 5,0; 6,0 и одинаковым количеством ТМБ (0,8 ммоль/л) имеют различный оттенок, что говорит о разной оксидазной активности фермента. Из рисунка 1 следует, что в более щелочной среде активность фермента уменьшается.
Зависимость оптической плотности окисленного ТМБ от времени при концентрации субстрата ТМБ 0,8 ммоль/л на длине волны 652 нм в присутствии НДЦ при pH 4,0; 5,0; 6,0

Рисунок 1 - Зависимость оптической плотности окисленного ТМБ от времени при концентрации субстрата ТМБ 0,8 ммоль/л на длине волны 652 нм в присутствии НДЦ при pH 4,0; 5,0; 6,0

Для дальнейшего расчета констант были измерены кинетические кривые образцов при одинаковых концентрациях наночастиц оксида церия (CeO2), но различных концентрациях субстрата (ТМБ: 0,1 ммоль/л, 0,2 ммоль/л, 0,4 ммоль/л, 0,6 ммоль/л, 0,8 ммоль/л). Полученные кривые приведены на рисунках 2-4.
Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=4,0

Рисунок 2 - Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=4,0

Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=5,0

Рисунок 3 - Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=5,0

Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=6,0

Рисунок 4 - Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=6,0

Далее была произведена обработка полученных кинетик по модели Лайнуивера-Берка, для этого были определены тангенсы углов наклона начальных участков графиков для кинетических кривых. Построенные в обратных координатах зависимости начальных скоростей реакции от концентрации субстрата ТМБ при разных значения pH среды представлены на рисунках 5-7.
График Лайнуивера-Берка при pH=4,0

Рисунок 5 - График Лайнуивера-Берка при pH=4,0

График Лайнуивера-Берка при pH=5,0

Рисунок 6 - График Лайнуивера-Берка при pH=5,0

График Лайнуивера-Берка при pH=6,0

Рисунок 7 - График Лайнуивера-Берка при pH=6,0

Рассчитанные по построенным графикам значения кинетических параметров приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Основные кинетические параметры процесса окисления ТМБ

Кинетический параметр

pH=4,0

pH=5,0

pH=6,0

[E], ммоль/л

0,408

KM, ммоль/л

0,134

0,216

0,373

υmax, мкмоль/л с

0,587

0,252

0,053

kcat, 10-3 с-1

1,436

0,616

0,130

kcat/ KM, л/с моль

10,739

2,848

0,349

где [E] – концентрация наночастиц CeO2;

KM – константа Михаэлиса;

υmax - максимальная скорость реакции;

kcat – каталитическая константа,

где kcatmax/[E];

kcat/ KM характеризует каталитическую эффективность наноэнзима.

Из таблицы видно, что значение KM наименьшее при pH среды равном 4,0. Как известно, более низкое значение константы Михаэлиса свидетельствует о более быстром и предпочтительном связывании субстрата с ферментом, т. е. о более высоком сродстве фермента к данному субстрату. Наибольшая скорость реакции и каталитическая эффективность также наблюдается при pH=4,0.

Таким образом, окисление хромогенного субстрата ТМБ в присутствии оксида церия свидетельствует об оксидазной активности наночастиц, при этом с уменьшение pH среды данный тип активности увеличивается.

4. Заключение

В данной работе было проведено исследование оксидазной активности наночастиц СеО2, стабилизированных мальтодекстрином, в зависимости от условий внешней среды, а именно – от величины кислотности среды. Установлено, что ферментативная активность наночастиц СеО2 сильно зависит от pH среды. Показано, что наночастицы наиболее активно проявляют оксидазные свойства в кислой среде, а при увеличении рН их активность снижается.

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали прооксидантные свойства наночастиц оксида церия, которые в значительной степени зависят от условий внешней среды. Возможное использование наночастиц СеО2 в медицине в качестве прооксидантов требует дальнейшего глубокого исследования их свойств и биологической активности.

Метрика статьи

Просмотров:318
Скачиваний:19
Просмотры
Всего:
Просмотров:318