ОКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА ЦЕРИЯ
ОКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА ЦЕРИЯ
Аннотация
Наночастицы оксида церия представляют собой перспективный материал для биомедицинского применения благодаря своей способности выполнять функции различных ферментов. В работе продемонстрирована возможность наночастиц имитировать поведение фермента оксидазы. Оксидазная активность наночастиц оксида церия была исследована с использованием буферного раствора и хромогенного субстрата 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ). В ходе работы были количественно оценены параметры ферментативной кинетики для процесса окисления ТМБ под действием наночастиц CeO2, обладающих оксидазной миметической активностью: определены значения максимальной скорости реакции, константы Михаэлиса, каталитической константы. Показано, что оксидазная активность стабилизированных мальтодекстрином наночастиц диоксида церия зависит от водородного показателя среды.
1. Введение
В настоящее время ключевую роль среди наноэнзимов играют наноматериалы на основе диоксида церия. Наночастицы диоксида церия (НДЦ) вызывают большой интерес из-за широкого спектра применения в различных областях, таких как топливные элементы , датчики газа , поглотители ультрафиолета , и биомедицинские приложения . НДЦ представляют интерес для медицины благодаря своей способности участвовать в процессах окисления-восстановления, обусловленной кислородной нестехиометрией. Именно присущая НДЦ кислородная нестехиометрия, образующаяся при удалении кислорода с поверхности, отвечает за его уникальную биологическую активность.
В зависимости от водородного показателя среды НДЦ проявляют как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства. Уникальность НДЦ заключается в возможности селективного уничтожения опухолевых клеток, которые характеризуются более кислым значением pH по сравнению со здоровыми. С одной стороны, в нейтральной среде наночастицы демонстрируют антиоксидантные свойства, что приводит к уменьшению окислительного стресса. С другой стороны, с уменьшением pH НДЦ наиболее активно проявляют прооксидантные свойства. В этом случае производство АФК увеличивается, а значит, гибель опухолевых клеток происходит эффективнее .
В литературе большое внимание уделяется исследованию антиоксидантных и прооксидантных свойств наночастиц СеО2, а также изучению его мультиферментативной активности, т.е. способности выполнять функции ферментов супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы и оксидазы .
Однако в литературе в настоящее время отсутствуют результаты комплексных исследований влияния кислотности среды на оксидазную активность наночастиц оксида церия. Более тщательное изучение этой темы, установление зависимости между этими параметрами позволит использовать НДЦ в качестве терапии для избирательного уничтожения злокачественных образований.
2. Методы и принципы исследования
Наночастицы оксида церия CeO2 в мальтодекстриновой оболочке были получены методом осаждения согласно методике, представленной в работе . Концентрация приготовленной суспензии наночастиц составила 10 мг/мл. С целью предотвращения образования агломератов частиц приготовленная суспензия подвергалась 30-минутной ультразвуковой обработке в ванне ПСБ-Галс. Для моделирования кислотности среды были приготовлены уксусно-ацетатные растворы трех значений pH: 4,0; 5,0; 6,0. Величина pH растворов контролировалась с помощью лабораторного иономера И-160МИ.
Оксидазная активность наночастиц церия была исследована с использованием буферного раствора и хромогенного субстрата 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ). В работе проведена серия опытов с разными значениями pH среды. Таблица 1 содержит список реагентов с указанием объемов и концентраций.
Таблица 1 - Объемы и концентрации реагентов
Реагент | Буфер, pH=4,0; 5,0; 6,0 | НДЦ | ТМБ |
Концентрация, мг/мл | - | 10 | 5 |
Объем, мкл | 4000 | 80 | 10; 20; 40; 60; 80 |
Измерения зависимостей оптической плотности растворов от времени были проведены с использованием спектрофотометра ПЭ-5400УФ на длине волны 652 нм в течение 300 секунд. Затем из значений оптической плотности растворов была рассчитана концентрация продукта окисления ТМБ в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера, при этом коэффициент молярного поглощения взят равным 39000 (моль/л)-1см-1 .
Согласно модели Михaэлисa – Ментен, при увеличении концентрации субстрaтa до определенного уровня скорость реакции достигает максимума:
где υ – скорость реакции при определенной концентрации субстрата;
υmax – максимальная скорость ферментативной реакции;
[S] – концентрация субстрата;
KM – константа Михаэлиса.
Путем линеаризации уравнения Михaэлисa – Ментен можно получить уравнение Лайнуивера- Берка (2):
где 1/υmax –пересечение с осью ординат;
KM /υmax – тангенс угла наклона прямой;
1/ KM –отрезок, отсекаемый на оси абсцисс.
3. Основные результаты и обсуждение
Рисунок 1 - Зависимость оптической плотности окисленного ТМБ от времени при концентрации субстрата ТМБ 0,8 ммоль/л на длине волны 652 нм в присутствии НДЦ при pH 4,0; 5,0; 6,0
Рисунок 2 - Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=4,0
Рисунок 3 - Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=5,0
Рисунок 4 - Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=6,0
Рисунок 5 - График Лайнуивера-Берка при pH=4,0
Рисунок 6 - График Лайнуивера-Берка при pH=5,0
Рисунок 7 - График Лайнуивера-Берка при pH=6,0
Таблица 2 - Основные кинетические параметры процесса окисления ТМБ
Кинетический параметр | pH=4,0 | pH=5,0 | pH=6,0 |
[E], ммоль/л | 0,408 | ||
KM, ммоль/л | 0,134 | 0,216 | 0,373 |
υmax, мкмоль/л с | 0,587 | 0,252 | 0,053 |
kcat, 10-3 с-1 | 1,436 | 0,616 | 0,130 |
kcat/ KM, л/с моль | 10,739 | 2,848 | 0,349 |
где [E] – концентрация наночастиц CeO2;
KM – константа Михаэлиса;
υmax - максимальная скорость реакции;
kcat – каталитическая константа,
где kcat=υmax/[E];
kcat/ KM характеризует каталитическую эффективность наноэнзима.
Из таблицы видно, что значение KM наименьшее при pH среды равном 4,0. Как известно, более низкое значение константы Михаэлиса свидетельствует о более быстром и предпочтительном связывании субстрата с ферментом, т. е. о более высоком сродстве фермента к данному субстрату. Наибольшая скорость реакции и каталитическая эффективность также наблюдается при pH=4,0.
Таким образом, окисление хромогенного субстрата ТМБ в присутствии оксида церия свидетельствует об оксидазной активности наночастиц, при этом с уменьшение pH среды данный тип активности увеличивается.
4. Заключение
В данной работе было проведено исследование оксидазной активности наночастиц СеО2, стабилизированных мальтодекстрином, в зависимости от условий внешней среды, а именно – от величины кислотности среды. Установлено, что ферментативная активность наночастиц СеО2 сильно зависит от pH среды. Показано, что наночастицы наиболее активно проявляют оксидазные свойства в кислой среде, а при увеличении рН их активность снижается.
Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали прооксидантные свойства наночастиц оксида церия, которые в значительной степени зависят от условий внешней среды. Возможное использование наночастиц СеО2 в медицине в качестве прооксидантов требует дальнейшего глубокого исследования их свойств и биологической активности.