Использование индекса нейтрализации вируса для выявления антител к целевому антигену в поливалентной сыворотке
Использование индекса нейтрализации вируса для выявления антител к целевому антигену в поливалентной сыворотке
Аннотация
Введение. Исследовали возможность использования индекса нейтрализации (NI) для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур в сыворотке крови кур, иммунизированных поливалентной инактивированной вакциной против ньюкаслской болезни (НБ), инфекционного бронхита кур (ИБК) и синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76) «Триовак Мульти» (ФГБУ «ВНИИЗЖ, г. Владимир). При этом валентность ИБК в составе вакцины представлена смесью антигенов трех штаммов: «ВНИИЗЖ793/В» (I), ВНИИЗЖ RF08-10 QX (II) и «Чапаевский» (III).
Материалы и методы. В работе использовали:
- штаммы вируса ИБК;
- сыворотки крови:
- от цыплят, выведенных из СПФ-эмбрионов кур (отрицательная сыворотка);
- от кур, содержащих антитела к вирусу НБ;
- от кур, содержащих антитела к вирусу CCЯ-76;
- от кур, иммунизированных поливалентной инактивированной вакциной «Триовак Мульти»;
- СПФ-эмбрионы кур (тест-объекты).
В реакции, где постоянная доза сыворотки воздействовала на последовательные разведения вируса, определяли индекс нейтрализации вида: lgIN = lgT0-lgT1, где T0 – инфекционный титр вируса после контакта с отрицательной сывороткой; T1 – инфекционный титр вируса после контакта с иммунной сывороткой. Значимость оценки lgIN (на уровне р < 0,05) проверяли используя неравенство (lgIN/S) ≥ 2, где S – соответствующее стандартное отклонение.
Результаты исследований. Установили, что сыворотки, содержащие антитела в только вирусам НБ и ССЯ-76, в реакции с вирусом ИБК не имели статистически значимых оценок lgIN±S, что свидетельствовало о специфичности теста. При этом сыворотка, полученная после применения вакцины «Триовак Мульти», показала высокую нейтрализующую активность по отношению ко всем тестируемым штаммам ИБК. Соответствующие средние показатели lg'IN±'S составили:
I) 2,694±0,313;
II) 3,434±0,151;
III) 3,278±0,319.
Коэффициенты вариации средних оценок находились в границах диапазона (%): 4,3-11,6.
Обсуждение и заключение. Исследование сыворотки крови кур, иммунизированных поливалентной инактивированной вакциной «Триовак Мульти», в которой одна из валентностей состоит из смеси антигенов трех штаммов вируса ИБК, показало, что использование индекса нейтрализации вируса позволяет достоверно определить наличие антител отдельно к каждому из трех штаммов вируса ИБК, исключая неспецифические реакции.
1. Введение
Для объективной оценки напряженности гуморального иммунитета после применения поливалентных вакцин (включающих нескольких антигенов) необходим раздельный анализ воздействия каждого антиген, исключая при этом неспецифические (гетерологичные) эффекты.
Настоящая работа проведена с сыворотками крови кур, иммунизированных вакциной против ньюкаслской болезни (НБ), инфекционного бронхита кур (ИБК) и синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76) инактивированной эмульсионной «Триовак Мульти» (ФГБУ «ВНИИЗЖ, г. Владимир). При этом валентность ИБК в составе вакцины представлена смесью антигенов трех штаммов.
Оценивали поствакцинальную гуморальную реакцию птиц отдельно на каждый антиген ИБК по нейтрализующему эффекту сыворотки в отношении вируса соответствующего штамма.
Использовали вариант реакции нейтрализации, при котором фиксированная доза иммунной сыворотки крови взаимодействует с последовательными разведениями вируса. Результат реакции выражали в виде соотношения (индекса) титров вируса, установленных после воздействия иммунной и контрольной (не иммунной) сывороток.
Целью работы было доказательство возможности использования данного варианта реакции нейтрализации для выявления антител к конкретным антигенам в сыворотке, содержащей различные антитела.
В рамках основной цели были определены задачи, позволяющие обосновать возможность использования индекса нейтрализации для выявления антител к целевому вирусу в полиспецифической сыворотке:
1. Оценить специфичность метода. Исключить статистически значимый эффект нейтрализации целевого вируса сыворотками, содержащими антитела к вирусам других видов;
2. Показать, что индекса нейтрализации вируса позволяет достоверно определить наличие антител в полиспецифической сыворотке отдельно к штаммам целевого вируса;
3. Определить коэффициенты вариации индексов нейтрализации, как ожидаемой статистической неопределенности результирующих оценок реакции.
Анализ проводили, опираясь на принципы, изложенные в известных научных публикациях, связанных с оценками концентрации инфекционного вируса и определением соответствующих статистических показателей , , , , .
2. Методы и принципы исследования
Штаммы вируса ИБК:
- штамм «ВНИИЗЖ793/В» серотипа 793/В;
- штамм «ВНИИЗЖ RF08-10 QX» серотипа «QX»;
- штамм «Чапаевский» серотипа «Массачусетс».
Все вирусные материалы хранили при (4±2)°С в виде вакуумированных лиофилизованных образцов, предназначенных для однократного вскрытия. Перед экспериментами лиофилизаты ресуспендировали до исходного объема в 0,9% растворе натрия хлорида (физиологическом растворе).
Сыворотки:
- сыворотка крови кур, свободная от антител к вирусам ИБК, ньюкаслской болезни (НБ), синдрома снижения яйценоскости -76 (ССЯ-76) и метапневмовирусной инфекции птиц (МПВИ) от цыплят в возрасте 28 суток, выведенных из СПФ-эмбрионов кур. Отсутствие антител к вирусам ИБК и ССЯ-76 подтверждали в ИФА, к вирусу НБ - в РТГА. Сыворотку использовали в качестве отрицательного контроля;
- содержащая антитела к вирусу НБ сыворотка крови цыплят, иммунизированных против НБ (в тексте – сыворотка "НБ"), и отобранная в возрасте 40 суток. Титр в РТГА составил 1:1024;
- содержащая антитела к вирусу CCЯ-76 сыворотка крови (в тексте – сыворотка "ССЯ") кур, иммунизированных против ССЯ-76, и отобранная в возрасте 120 суток. Титр в РТГА составил 1:2048;
- смесь образцов сыворотки крови от 25 кур в возрасте 150 суток. Образцы полученны через 28 суток после иммунизации инактивированной эмульсионной вакциной против ньюкаслской болезни (НБ), инфекционного бронхита кур (ИБК) и синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76) «Триовак Мульти» (в тексте – Триовак). В составе вакцины валентность ИБК представлена смесью антигенов штаммов «ВНИИЗЖ793/В» серотипа 793/В, штамм «ВНИИЗЖ RF08-10 QX» серотипа «QX» и штамм «Чапаевский» серотипа «Массачусетс». Пробы сыворотки исследованы на присутствие антител к трем антигенным валентностям вакцины. Среднегеометрические значения титров антител (n=25), соответственно валентностям, составили: НБ - 1:1753 (оценка в РТГА); ИБК - 1:4855 (оценка в ИФА); ССЯ-76 - 1:924 (оценка в РТГА).
Все сыворотки были расфасованы по 1см³ в герметичные криопробирки (для однократного использования) и хранились при минус (40±5)°С. Перед экспериментами сыворотки проходили термообработку при (56±1)°С в течение 30 минут.
Чувствительные тест-объекты: Для оценки инфекционного титра вируса в качестве чувствительных тест-объектов использовали СПФ-эмбрионы кур 9-10-суточной инкубации от поставщика/производителя: VALO BioMedia GmbH, Sachsenring 11, 27711 Osterholz-Scharmeeck, Germany.
Процедура постановки реакции. На физиологическом растворе готовили последовательные десятикратные разведения вирусного материала данного штамма для реакции с контрольной и тестируемыми сыворотками (в тексте величина разведения указана в положительных десятичных логарифмах). В каждое разведение вносили 1/5 объема сыворотки. Полученные смеси на 30 мин помещали в термостат, после чего применяли для заражения эмбрионов. Вирусный материал в объеме 0,2 см³ вводили шприцом в аллантоисную полость эмбриона через отверстие в скорлупе. Инфицированные эмбрионы содержали в термостате в течение 7 суток.
Оценка результатов. Ежедневно проводили осмотр инфицированных эмбрионов в проходящем свете (овоскопию). Гибель эмбрионов в течение первых 24 ч после заражения, считали неспецифической. По истечение 24 ч, в продолжение 7 суток у эмбрионов оценивали реакцию на вирусную инфекцию (гибель, или характерные дефекты развития). Результат клинических наблюдений интерпретировали однозначно: объект либо проявлял клинический признак (реакция положительная), либо не проявлял (реакция отрицательная).
Обработка экспериментальных данных. Расчет логарифмической величины титра 50%-ных эмбриональных инфицирующих доз (Т, lgЭИД₅₀) выполняли по методу Спирмена-Кербера . Вычисляли стандартное отклонение (±s) оценки титра . При анализе экспериментального материала опирались на положения о статистической неопределенности измерений, изложенные в ГОСТ 34100.3 . Для проверки статистической значимости оценки индекса нейтрализации на уровне р < 0,05, использовали общую дисперсию двух установленных параллельно значений титров (S2=s12+s22) . Процедура проведения вычислительных операций представлена в виде алгоритма с примером в таблице 1.
Таблица 1 - Алгоритм расчета индекса нейтрализации вируса
Принцип. Разведениями вируса с контрольной (контроль) и иммунной (опыт) сыворотками инфицируют чувствительные тест-объекты. Определяют и сравнивают значения инфекционных титров вируса, установленных в контроле (T₀) и в опыте (Т₁). Оценочным показателем реакции является величина индекса нейтрализации вида NI = T₀/Т₁, или lgNI = lgT₀ - lgТ₁. | |||||||||||||||||||||||
Обозначения | Формулы и пояснения | ||||||||||||||||||||||
h | кратность (шаг) последовательных разведений вирусного материала (h=10) | ||||||||||||||||||||||
х | логарифм величины разведения: х=lg d, где d - положительная величина разведения («во сколько раз разведено») | ||||||||||||||||||||||
v | объем инъекции вирусного материала в тест-объект (v=0,2 см³) | ||||||||||||||||||||||
- ; +; θ | оценка реакции тест-объекта: «-» - отрицательная; «+» - положительная; «θ» - неспецифическая (тест-объект исключен) | ||||||||||||||||||||||
С | доля положительных реакций в группе: C=e/n, где: e - количество положительно реагирующих тест-объектов; n - общее число тест-объектов в группе, на которых испытано данное разведение | ||||||||||||||||||||||
Х | логарифм наибольшего разведения вирусного материала, при котором С = 1 | ||||||||||||||||||||||
lgТ/v | логарифмическая оценка титра 50%-х эмбриональных инфицирующих доз (ЭИД₅₀) вируса в тестируемом объеме: lgТ/v = Х + lgh×(Σс+0,5), где Σс - сумма всех С<1 | ||||||||||||||||||||||
q²* | дисперсия величины С: q² = [С(1-С)]/(n-1) | ||||||||||||||||||||||
s | стандартное отклонение оценки титра: s = √(Σ q²) | ||||||||||||||||||||||
Пример. Результаты реакции вируса ИБК штамма «Чапаевский» с контрольной и иммунной сывороткой "ИБК" | |||||||||||||||||||||||
Реакция с контрольной сывороткой (контроль) | |||||||||||||||||||||||
Оценки | х | Σ | |||||||||||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | Х=5 | 6 | 7 | |||||||||||||||||
- ; +; θ | + + + + + + | + + + + + + | + + + + + + | + + + + + + | Ө + + + + + | Ө + + + - - | - - - - - - | ||||||||||||||||
C | 6/6=1 | 6/6=1 | 6/6=1 | 6/6=1 | 5/5=1 | 3/5=0,6 | 0/6=0 | 0,600 | |||||||||||||||
q² | - | - | - | - | - | 0,060 | - | 0,060 | |||||||||||||||
Обработка данных: lgТ₀ = 5+1×(0,6+0,5)=6,100; s₀ = √(0,060) = 0,245 | |||||||||||||||||||||||
Реакция с иммунной сывороткой (опыт) | |||||||||||||||||||||||
Оценки | Логарифмы разведений вирусного материала (lgd = x) | Σ | |||||||||||||||||||||
1 | х=2* | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |||||||||||||||||
- ; +; θ | Ө + + + + + | Ө + + + + + | + + - - - - | - - - - - - | + - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | ||||||||||||||||
C = e/n | 5/5=1 | 5/5=1 | 2/6=0,333 | 0/6=0 | 1/6=0,167 | 0/6=0 | 0/6=0 | 0,500 | |||||||||||||||
q² | - | - | 0,044 | - | 0,028 | - | - | 0,072 | |||||||||||||||
Обработка данных: lgТ₁ = 2+1×(0,5+0,5)=3,000; s₁ = √(0,072) = 0,268 | |||||||||||||||||||||||
Расчет логарифмической величины индекса нейтрализации lgNI = lgT₀ - lgT₁ = 6,100 - 3,000=3,100 | |||||||||||||||||||||||
Расчет стандартного отклонения индекса: ±S=√(s₀² - s₁²) = √(0,245² + 0,268²) = 0,363 | |||||||||||||||||||||||
Оценка значимости установленной величины индекса на уровне р ≤ 0,05. Проверка выполнимости неравенства |lgNI|/S) ≥ 2. |lgIN|/S = 3,100/0,363 = 8,540 > 2 | |||||||||||||||||||||||
Заключение Неравенство |lgNI|/S = 8,540 > 2 выполняется, на этом основании величину lgNI=(3,1±0,364) считают значимой (р<<0,05). | |||||||||||||||||||||||
*Дополнение к алгоритму: значения q² соответственно величинам n и е (для n от 2 до 10) | |||||||||||||||||||||||
n | e | ||||||||||||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |||||||||||||||
2 | 0,250 | ||||||||||||||||||||||
3 | 0,111 | 0,111 | |||||||||||||||||||||
4 | 0,063 | 0,083 | 0,063 | ||||||||||||||||||||
5 | 0,040 | 0,060 | 0,060 | 0,040 | |||||||||||||||||||
6 | 0,028 | 0,044 | 0,050 | 0,044 | 0,028 | ||||||||||||||||||
7 | 0,020 | 0,034 | 0,041 | 0,041 | 0,034 | 0,020 | |||||||||||||||||
8 | 0,016 | 0,027 | 0,033 | 0,036 | 0,033 | 0,027 | 0,016 | ||||||||||||||||
9 | 0,012 | 0,022 | 0,028 | 0,031 | 0,031 | 0,028 | 0,022 | 0,012 | |||||||||||||||
10 | 0,010 | 0,018 | 0,023 | 0,027 | 0,028 | 0,027 | 0,023 | 0,018 | 0,010 | ||||||||||||||
Примечание: lg NI±S
3. Основные результаты
Определение специфичности индекса нейтрализации. В исследовании возможности проявления неспецифического эффекта нейтрализации вируса ИБК сыворотками, содержащими антитела к вирусам других видов, определяли оценки lgNI±S и статистическую значимость показателей, установленных для штамма «ВНИИЗЖ793/В» серотипа 793/В, штамма «ВНИИЗЖ RF08-10 QX» серотипа «QX», и штамма «Чапаевский» серотипа «Массачусетс» в реакциях и сыворотками “НБ и “ССЯ. Провели три опыта, полученные результаты представили в таблице 2.
Таблица 2 - Индексы нейтрализации, установленные для штаммов вируса ИБК в реакциях с сыворотками, полученными на другие виды вирусов
Соответственно номеру опыта (№) и штамму вируса (I - «ВНИИЗЖ793/В», II - «ВНИИЗЖ RF08-10 QX», III - «Чапаевский») даны значения титров, установленные после контакта с контрольной (lgТ0±s) и иммунными сыворотками (lgТ1±s), а также оценки индексов (lgNI±S) и отношение вида │lgNI│/S для проверки значимости полученной оценки*. | ||||||
№ | Штамм | lgТ0±s | Иммунная сыворотка | lgТ1±s | (lgNI±S) | │lgNI│/S |
1 | I | 6,047±0,245 | “НБ | 5,834±0,297 | 0,163±0,385 | 0,423 |
“ССЯ | 5,986±0,358 | 0,061±0,431 | 0,142 | |||
II | 6,024±0,234 | “НБ | 6,215±0,315 | - 0,191±0,392 | 0,487 | |
“ССЯ | 5,841±0,387 | 0,183±0,452 | 0,405 | |||
III | 6,192±0,310 | “НБ | 6,012±0,245 | 0,180±0,395 | 0,456 | |
“ССЯ | 6,121±0,333 | 0,071±0,455 | 0,156 | |||
2 | I | 5,880±0,340 | “НБ | 6,095±0,163 | -0,215±0,377 | 0,570 |
“ССЯ | 5,912±0,233 | -0,032±0,412 | 0,078 | |||
II | 6,280±0,322 | “НБ | 6,130±0,280 | 0,150±0,427 | 0,351 | |
“ССЯ | 6,320±0,390 | 0,040±0,506 | 0,079 | |||
III | 5,890±0,301 | “НБ | 5,803±0,317 | 0,087±0,437 | 0,199 | |
“ССЯ | 5,706±0,331 | 0,184±0,447 | 0,412 | |||
3 | I | 5,920±0,261 | “НБ | 6,120±0,226 | -0,200±0,345 | 0,580 |
“ССЯ | 6,022±0,248 | -0,102±0,360 | 0,283 | |||
II | 6,140±0,332 | “НБ | 5,930±0,322 | 0,210±0,463 | 0,454 | |
“ССЯ | 6,115±0,340 | 0,025±0,475 | 0,052 | |||
III | 6,180±0,242 | “НБ | 6,066±0,266 | 0,114±0,360 | 0,317 | |
“ССЯ | 6,207±0,232 | -0,027±0,335 | 0,081 | |||
Примечание: “НБ, “ССЯ; * - оценку индекса нейтрализации считали значимой (р ≈ 0,05), если выполнялось неравенство вида: lgNI/S ≥ 2
Из данных таблицы 2 следовало, что критериальное неравенство │lgNI│/S≥2 ни в одном случае не было выполнено, т. е. все установленные индексы нейтрализации не имели статистической значимости. Без учета статистики однократных опытов, средняя оценка общей выборки неспецифических индексов составила (0,042±0,160) lg. На этом основании считали, что уровень неспецифической реакции исследуемых сывороток по отношению к штаммам ИБК находится в границах стандартных отклонений эмпирических величин lg NI.
Показатели lgNI±S, установленные для штаммов вируса ИБК в реакциях с сыворотками, содержащими антитела к данному возбудителю. Определяли значения и статистические характеристики индексов нейтрализации для штаммов вируса ИБК «ВНИИЗЖ793/В», «ВНИИЗЖ RF08-10 QX» и «Чапаевский», установленных в реакциях с сывороткой крови кур, полученной из птицефабрики через 28 суток после иммунизации поливалентной вакциной «ТРИОВАК Мульти».
Таблица 3 - Индексы нейтрализации, установленные для штаммов вируса ИБК в реакциях с сывороткой крови кур, полученной из птицефабрики через 28 суток после иммунизации вакциной «ТРИОВАК Мульти»
Соответственно номеру опыта (№) и штамму вируса (I – «ВНИИЗЖ793/В», II – «ВНИИЗЖ RF08-10 QX», III – «Чапаевский») даны значения титров, установленные после контакта с контрольной (lgТ0±s) и иммунной сывороткой “Триовак (lgТ1±s), а также оценки индексов (lgNI±S) и отношение вида │lgNI│/S для проверки значимости индекса* | ||||||
№ | Штамм | lgТ0±s | Иммунная сыворотка | lgТ1±s | (lgNI±S) | │lgNI│/S |
1 | I | 5,167±0,316 | “Триовак | 2,834±0,237 | 2,333±0,395 | 5,906 |
II | 5,866±0,385 | 2,334±0,286 | 3,532±0,469 | 7,531 | ||
III | 6,112±0,246 | 2,466±0,268 | 3,646±0,364 | 10,016 | ||
2 | I | 5,960±0,310 | “Триовак | 3,095±0,123 | 2,865±0,332 | 8,630 |
II | 6,191±0,282 | 2,930±0,210 | 3,261±0,352 | 9,264 | ||
III | 5,890±0,301 | 2,803±0,217 | 3,087±0,372 | 8,298 | ||
2 | I | 5,905±0,261 | “Триовак | 3,020±0,226 | 2,885±0,345 | 8,362 |
II | 6,040±0,222 | 2,530±0,302 | 3,510±0,375 | 9,360 | ||
III | 6,100±0,245 | 3,000±0,268 | 3,100±0,363 | 8,340 | ||
Примечание: * - оценку индекса нейтрализации считали значимой (р ≈ 0,05), если выполнялось неравенство вида lgNI/S ≥ 2.
Данные таблицы 3 демонстрируют, что критериальное неравенство │lgNI│/S ≥ 2 во всех случаях выполнялось, т. е. все установленные индексы нейтрализации были статистически значимы. При этом уровень значимости значительно превосходил р=0,05.
На основании данных, полученных в реакции с сывороткой “Триовак, для каждого штамма вируса ИБК (без учета статистики однократных опытов) были рассчитаны средние оценки индексов (lg'NI), стандартные отклонения ('S) и коэффициенты вариации (kv, %). Указанные величины соответственно штаммов вируса приведены в таблице 4.
Таблица 4 - Средние оценки индексов нейтрализации (lg'NI), стандартные отклонения (‘S) и коэффициенты вариации (kv), установленные для штаммов вируса ИБК по данным трех опытов с сывороткой “Триовак
Штамм | lg'NI | ‘S | kv = (‘S/(lg'NI))×100, % |
ВНИИЗЖ793/В | 2,694 | 0,313 | 11,6 |
ВНИИЗЖ RF08-10 QX | 3,434 | 0,151 | 4,3 |
Чапаевский | 3,278 | 0,319 | 9,7 |
Представленные в таблице 4 величины позволили считать, что реакции, проведенные со всеми изученными штаммами, имеют удовлетворительную воспроизводимость, характеризуемую коэффициентами вариации в границах от 4,3 до 11,6 %%.
Вирусологические методы, где в качестве тест-объектов используют биологические системы, как правило, имеют высокую степень статистической неопределенности конечного результата. Например, при сопоставлении двух величин инфекционных титров вируса допускается, что доверительный интервал (p=0,05) их логарифмической разности может достигать 0,5 lg , т.е. результирующий показатель может варьировать более чем в три раза.
Надежным способом снижения естественных вариаций является параллельный контроль и получение относительных показателей (индексов). Такой метод постановки вирусологических тестов известен и применяется на практике для количественной оценки воздействия какого-либо фактора ингибиции инфекционности вируса , , в том числе и нейтрализующего действия иммунной сыворотки , , . Следует подчеркнуть, что именно индекс нейтрализации вируса используется в наиболее ответственных областях эпиданализа , , .
В доступной литературе вариант постановки реакции по индексу нейтрализации вируса освещен значительно меньше, чем по нейтрализующим дозам сыворотки. Особенно это касается оценки достоверности и интерпретации результатов. Например, принято считать, что значение lgNI ≥ 1,7 (или T₁/ T₀ ≥ 50), установленное при воздействии 1/5 объема иммунной сыворотки, соответствует достоверной гомологичной реакции , . Однако объяснений этому показателю не приводится.
В целом представляется, что индекс нейтрализации значительно более надежная оценка в сравнении с титром нейтрализующих доз сыворотки, который требует достаточно точной корректировки по количеству нейтрализуемого вируса , , . Конечно, следует понимать, что количественные характеристики эффективности взаимодействий в системе «антиген-антитело» являются дискуссионными, однако непреложным остаются положения о соотношении концентраций и о рецепторной аффинности . Другими словами, определяющими являются фактор вероятности образования комплексов антиген-антитело и фактор тесноты связи. Индекс нейтрализации, очевидно, отражает влияние обоих указанных факторов. При этом статистическая значимость каждой эмпирической оценки индекса может быть легко проверена по соотношению со стандартным отклонением с использованием карманного калькулятора.
4. Заключение
В результате проведенной работы было установлено, что использованный методический подход к дифференцированной оценке гуморального иммунитета может быть рекомендован на практике при необходимости достоверного определения наличия антител к заданному вирусу в сыворотках крови птиц, вакцинированных поливалентными препаратами.