ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОПУХОЛИ ТОЛСТОЙ КИШКИ НА ФОНЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА

Стручко Г.Ю¹., Меркулова Л.М.², Москвичев Е.В.³, Кострова О.Ю.⁴, Михайлова М.Н.⁵

¹доктор медицинских наук, профессор,

Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова;

² доктор медицинских наук, профессор,

Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова;

³кандидат медицинских наук, доцент,

Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова;

⁴аспирант, Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова;

⁵кандидат медицинских наук, доцент,

Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОПУХОЛИ ТОЛСТОЙ КИШКИ НА ФОНЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА

Аннотация

Исследована морфология и иммуногистохимия опухоли толстой кишки у крыс после введения канцерогена и на фоне вторичного иммунодефицита. Выявлено, что злокачественные новообразования в  группе животных с введением канцерогена на фоне спленэктомии отличаются более агрессивным морфологическим фенотипом и ранним появлением отдаленных метастазов. При этом у спленэктомированных крыс на долю высокодифференцированных форм приходилось до 48% животных, умеренно дифференцированные аденокарциномы составляли 38%, низкодифференцированные формы - 6 % опухолей. Установлено, что экспрессия белка p53 и bcl-2 выявлялись в 20 и 10% высокодифференцированных опухолей, в 64 и 28% - с умеренной дифференцировкой и в 100 и 17% - в низкодифференцированных новообразованиях соответственно. Опухоли у крыс с вторичным иммунодефицитом характеризуются достоверно более высокой экспрессией маркеров ангиогенеза: позитивную реакцию с VEGF дают до 8% клеток в опухолях с GRADE 1 и 36% клеток опухолей с GRADE 2. В низкодифференцированных клетках реакция с VEGF была достоверно более интенсивная и составила 44%.

Ключевые слова: канцерогенез, иммунодефицит, спленэктомия, маркеры агрессии опухоли.

Struchko G.Yu.¹, Merkulova L.M.², Moskvichev E.V.³, Kostrova O.Yu.⁴, Mikhailova M.N.⁵

¹PhD in Medicine, professor, ChuvashStateUniversity;

² PhD in Medicine, professor, ChuvashStateUniversity;

³PhD in Medicine, associate professor, ChuvashStateUniversity;

⁴ Postgraduate student, ChuvashStateUniversity;

⁵PhD in Medicine, associate professor, ChuvashStateUniversity;

IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF COLON CANCER IN CONDITION OF EXPERIMENTAL IMMUNODEFICIENCY

Abstract

The morphology and immunohistochemistry of colon tumors in rats after administration of carcinogen and on the background of secondary immunodeficiency had been investigated. Found that malignant tumors in the group of animals with the introduction of a carcinogen on the background of splenectomy are more aggressive phenotype and early morphological appearance of distant metastases. At the same time at rats after the splenectomy the share of highly differentiated forms accounted for 48% of the animals, moderately differentiated adenocarcinoma accounted for 38%, poorly differentiated forms - 6% of tumors. It is established that the expression of p53 protein and bcl-2 were detected in 20 and 10% of highly differentiated tumors, 64 and 28% - with moderate differentiation, and in 100 and 17% - in poorly differentiated tumors, respectively. Tumors in rats with secondary immunodeficiency characterized by significantly higher expression of markers of angiogenesis: a positive response to VEGF provide up to 8% of the cells in tumors with GRADE 1 and 36% of tumor cells with GRADE 2. In the poorly differentiated cells with VEGF response was significantly more intense and was 44%.

Keywords: carcinogenesis, immune deficiencies, splenectomy, markers of tumor aggression.

Известно, что иммунные механизмы начинают работать задолго до появления клинически определяемой опухоли и продолжают играть значимую роль после избавления от нее [1,2]. Выяснено, что опухоль формируется и растет под влиянием противоположно направленных, но не взаимоисключающих иммунных реакций. Активность опухолевого роста определяется равновесием между противоопухолевыми и пробластомными факторами, способствующими росту опухоли [1,3].

         Сложные механизмы взаимодействия злокачественной опухоли и иммунной системы отражают важнейшую функцию иммунной системы – регулирование процессов регенерации и размножения клеток [4,5,6]. Возможно, что специфический иммунитет ответственен не за уничтожение злокачественных клеток, а за регуляцию их роста и развития. Механизмы же неспецифической иммунной защиты, согласно последним данным, могут иметь решающее значение в предотвращении онкологических заболеваний [2,7]. Именно поэтому изучение перехода предопухолевых изменений в опухоль, формирование самой опухоли и ее морфологических характеристик, особенно в условиях нарушения функционирования иммунной системы, является весьма значимым и актуальным.

В последние годы усилия морфологов и онкологов направлены на выявление дополнительных прогностических признаков, которые позволяют выяснить причины различного поведения опухолей в зависимости от исходного иммунного статуса [8,9]. Важнейшими характеристиками злокачественного роста являются его гистологический вариант, степень дифференцировки и биологическая агрессивность [3,10]. Оценить биологическую агрессивность первичной опухоли можно, исследуя показатели ее пролиферативной активности, интенсивности апоптоза, а также состояния ряда основных регуляторных рецепторов и систем [11,12].

Таким образом, изучение перечисленных выше механизмов даст новое, более целостное концептуальное представление о патогенезе канцерогенеза, что, в дальнейшем, позволит разработать более эффективные методы прогнозирования, мониторирования и лечения злокачественных новообразований.

Работа выполнена на 72 белых нелинейных крысах-самцах массой 160-240 грамм. Уход и содержание животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Крысы были разделены на 4 группы. Животным первой группы (24 крысы) под общей анестезией выполнялась спленэктомия. Через 30 суток после операции животным внутрибрюшинно вводили канцероген – 1,2-диметилгидрозин в дозе 20 мг/кг массы четырехкратно с интервалом 7 суток. Животным второй группы (24 крысы) вводили канцероген в выше указанной дозе без удаления селезенки. Контролем служили спленэктомированные (12 крыс) и интактные животные (12 крыс). Выведение животных из эксперимента проводили через 2, 3 и 5 месяцев после окончания введения канцерогена. Объектом исследования служили органы ЖКТ и новообразования. При патоморфологическом исследовании учитывались частота развития новообразований, их морфологические особенности, локализация.

В работе применялись следующие методы:

1. Для иммуногистохимического исследования опухоли были использованы моноклональные антитела фирмы Santa Cruze: маркеры клеточной пролиферации (Ki-67 и PCNA); белки-регуляторы апоптоза bcl-2 и p-53 и маркер ангиогенеза – сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF).

Материал для исследования готовили по стандартной методике. Для выявления иммуногистохимической реакции использовалась система визуализации Novolink Polymer Detection System (Novocastra), контролем иммуногистохимической реакции служила неиммунизированная кроличья сыворотка. Результат реакции оценивали путем подсчета позитивно окрашенных клеток на 100 клеток в десяти полях зрения, выражая результаты в процентах.

1. Окраска гистологических срезов опухолевой и прилежащей к ней ткани гематоксилином и эозином - для оценки степени дифференцировки опухоли, характера изменений покровного эпителия, желез и стадии опухолевого процесса.
2. Компьютерная морфометрия для определения ядерно-цитоплазматического соотношения и количественных характеристик иммуногистохимических реакций проводилась с использованием лицензионных программ Leica application suite 3.6.0 и Микроанализ. Данные обрабатывались статистически, достоверность определялась t-критерием Стьюдента.

Нами установлено, что через 2 и 3 месяца после окончания введения канцерогена в обеих экспериментальных группах в слизистой оболочке дистального отдела толстой кишки развивались сходные предопухолевые изменения: утолщение слизистой за счет очаговой пролиферации клеток кишечных крипт, развитие аденоматозных полипов с признаками клеточной дисплазии различной степени. Однако выявлены отличия в молекулярном фенотипе предопухолевых изменений.

Использование моноклональных антител к белку p53 позволило зарегистрировать равномерную ядерную окраску в 28% опухолей у крыс на фоне спленэктомии и лишь в 16%  - у животных с изолированным введением канцерогена. Экспрессия bcl-2 в клетках аденом толстой кишки была менее значительная и составила 10 и 14% соответственно. Следует отметить, что цитоплазматическая экспрессия bcl-2 отмечалась лишь в неизмененных железах аденом, тогда как в железах, подверженных клеточной дисплазии, экспрессия этого антигена отсутствовала.

Кроме того, иммуногистохимическое исследование препаратов толстой кишки выявило высокую митотическую активность в пролифератах кишечных крипт в обеих экспериментальных группах. Позитивную реакцию с Ki-67 у животных с изолированным введением канцерогена давали 35% клеток аденом, на фоне спленэктомии - до 33%.  При обработке препаратов антителами к PCNA положительную реакцию давали 54% ядер желез в аденомах крыс при изолированном введении канцерогена и 62% ядер - на фоне спленэктомии.

При морфометрическом исследовании интенсивности ангиогенеза установлено, что в реакцию с VEGF вступают до 12,5% стромальных клеток аденом у животных с изолированным введением канцерогена и 18% клеток - у крыс на фоне вторичного иммунодефицита.

Таким образом, в развивающихся аденомах крыс на фоне удаления селезенки отмечена более высокая экспрессия белка-регулятора апоптоза p-53 и ангиогенного фактора VEGF.

Через 5 месяцев после окончания введения канцерогена в толстой  кишке крыс обеих групп формируются одна, реже две опухоли. Чаще опухоли имеют эндофитный или циркулярный тип роста и глубокую инвазию в кишечную стенку с переходом на серозную оболочку и околокишечную жировую клетчатку. Размеры опухоли вариабельны, но чаще не превышают 1 см. Морфологически опухоли представлены аденокарциномой, преимущественно высокой и умеренной степени дифференцировки.

У 42% крыс на фоне спленэктомии помимо опухолей толстой кишки отмечалось формирование множественных изъязвлений слизистой оболочки дистального отдела пищевода.  При микроскопическом исследовании в них выявлялись признаки лейкоплакии с папилломатозом и акантозом, а также дисплазии многослойного плоского неороговевающего эпителия. У 17% крыс изменения соответствовали внутриэпителиальному  плоскоклеточному раку с очагами микроинвазии.

По степени клеточной дифференцировки на долю высокодифференцированных форм приходилось до 62% от общего числа опухолей у крыс с изолированным введением канцерогена и до 48% - у животных на фоне спленэктомии. Умеренно дифференцированные аденокарциномы составляли 46% и 40% соответственно. Низкодифференцированные формы (включая солидную аденокарциному) встречались только у крыс с иммунодефицитом (до 6% опухолей).

Специфическая дифференцировка опухолевых клеток может быть выражена в различной степени. В настоящее время принята классификация по степени GRADE (ВОЗ 2000), основанная на способности опухоли образовывать тубулярные структуры (для аденокарцином): GRADE 1 – высокая (95% и более), GRADE 2 – средняя (50-94%), GRADE 3 – низкая (5-50%), GRADE 4 – недифференцированная (менее 5%).

При сравнении экспрессии маркеров клеточной пролиферации в опухолях у животных двух групп были выявлены достоверные отличия. Установлено, что высокую интенсивность клеточной пролиферации  Ki-67 у крыс первой группы имеют 18% опухолей с GRADE 1 и  52% - c GRADE 2. Тогда как у животных второй группы высокая пролиферация опухолевых клеток составляла в 21% опухолей с GRADE 1, в 78% - с  GRADE 2 и в 100% - с GRADE 3. Интенсивная ядерная экспрессия PCNA была отмечена в 34% опухолей с GRADE 1 и  67% - c GRADE 2 у животных первой группы, тогда как у крыс с иммунной недостаточностью экспрессия этого антигена составила 28% с GRADE 1, 62% - с GRADE 2 и 100% - с GRADE 3.

Установлено, что злокачественные опухоли, развившиеся на фоне вторичного иммунодефицита, имеют достоверно более низкую степень клеточной дифференцировки и достоверно более высокий индекс клеточной пролиферации Ki-67. Достоверных отличий в экспрессии маркера PCNA в опухолях двух групп не выявлено.

При исследовании факторов ангиогенеза в опухолях крыс с изолированным введением канцерогена установлено, что позитивную иммуногистохимическую реакцию дают не только клетки стромы, но и некоторые опухолевые клетки. Реакция к VEGF проявляется в виде цитоплазматического окрашивания клеток стромы опухоли между железами, а так же цитоплазматического окрашивания самих опухолевых клеток. С помощью компьютерной морфометрии установлено, что в группе животных с изолированным введением канцерогена позитивную реакцию с VEGF дают до 9% клеток опухоли с GRADE 1 и до 21% клеток с GRADE 2, причем в зоне инвазивного роста экспрессия VEGF была выше, чем в слоях опухоли, лежащих поверхностно.

Опухоли у крыс на фоне вторичного иммунодефицита характеризуются достоверно более высокой экспрессией маркеров ангиогенеза. Позитивная реакция к VEGF отмечена и в строме опухоли, и в самих опухолевых клетках. Установлено, что позитивную реакцию с VEGF дают до 8% клеток в опухолях с GRADE 1 и 36% клеток опухолей с GRADE 2. В низкодифференцированных клетках реакция с VEGF была достоверно более интенсивная и составила 44%.

Изучение фактора апоптоза bcl-2 и белка-супрессора p53 выявило достоверное отличие в исследуемых группах крыс. В высокодифференцированных опухолях у крыс с изолированным введением канцерогена гиперэкспрессия p53 выявляется в 17% опухолей, в умеренно дифференцированных - в 33%. В опухолях крыс на фоне вторичной иммунной недостаточности гиперэкспрессия белка p-53 выявлялась в 20% случаях у высокодифференцированных опухолей, в 64% - с умеренной дифференцировкой и в 100% - у низкодифференцированных новообразований.

Экспрессия bcl-2 была отмечена в 9% клеток опухолей с высокой степенью дифференцировки и в 19% опухолей с умеренной дифференцировкой клеток в группе животных с изолированным ведением канцерогена. На фоне спленэктомии позитивную реакцию с bcl-2 давали 10% клеток высокодифференцированных опухолей, 28% клеток умеренно дифференцированных опухолей и 17% клеток опухолей низкой степени дифференцировки. Следует отметить, что позитивная реакция к bcl-2 отмечалась не только в цитоплазме опухолевых клеток, но и в многочисленных клетках лимфоцитарной инфильтрации.

Наши исследования показали, что злокачественные новообразования развиваются у крыс как после изолированного введения канцерогена, так и на фоне спленэктомии, однако в последней группе канцерогенез протекает иначе. Это проявляется более агрессивным морфологическим фенотипом опухолей и ранним появлением отдаленных метастазов.

Наши данные полностью согласуются с результатами Н.А. Горбань (2008), которая обнаружила прямую зависимость уровня Ki-67 и PCNA с агрессивностью роста опухоли [13]. Кроме того, нами установлена четкая связь между пролиферативной активностью и степенью дифференцировки опухоли, но слабая зависимость уровня Ki-67 и PCNA с выявлением отдаленных метастазов.

Как известно, клеточное постоянство любого органа регулируется генетическими программами, одна из которых определяет интенсивность клеточного деления, другая – клеточную гибель (апоптоз). В настоящее время принято считать, что гены, участвующие в регуляции роста и развития опухолей (онкогены и гены-супрессоры опухолей), играют регулирующую роль в индукции апоптоза. К ним относятся белок bcl-2, который ингибирует апоптоз, вызванный гормонами и цитокинами, и приводит тем самым к удлинению жизни клетки [14,15]. Сюда же относят белок р53, который в норме активирует апоптоз, но при мутации (что обнаружено в некоторых опухолях) повышает выживаемость клеток [3,13].

Также установлено, что коэкспрессия мутантного белка р53 и ингибитора апоптоза bcl-2, а также маркеров пролиферативной активности Ki-67 и PCNA является значимым прогностическим фактором при раке. Гиперэкспрессия белка р53 и высокий уровень Ki-67 имеют потенциально неблагоприятный прогноз, связанный с высоким риском развития рецидивов, низкой выживаемостью, а также наличием метастазов [13]. Именно это и наблюдается в нашем эксперименте у крыс с введением канцерогена на фоне спленэктомии.

Опухолевый рост сопровождается реакцией со стороны иммунной системы [2]. Иммунный статус зависит как от типа опухоли, стадии процесса, так и от индивидуальных особенностей организма. Недостаточность иммунной системы, в свою очередь, может привести в развитию опухоли [6]. Удаление селезенки приводит к стойкому снижению CD3 и CD4, фактора некроза опухоли, ИЛ-1 и 2, α-интерферона, дисбалансу в гуморальном звене иммунитета [6,16]. В связи с этим не развивается адекватный иммунный ответ, направленный на уничтожение опухолевой ткани за счет работы компонентов противоопухолевой защиты (как клеточных, так и гуморальных). Кроме того, в связи с развитием постспленэктомического гипоспленизма и значительным дисбалансом иммунной и эндокринной системы развивающаяся опухоль быстро ускользает от иммунного надзора за счет факторов иммунорезистентности опухоли (выделение растворимых опухолевых антигенов, приобретение устойчивости к апоптозу клеток за счет потери рецептора в фактору некроза опухоли, продукция в большом количестве ИЛ-6 и ИЛ-10).

Мы полагаем, что выявленные после спленэктомии агрессивность роста опухоли, развитие синхронного рака разных отделов ЖКТ и ранние отдаленные метастазы могут быть связаны с появлением в крови проопухолевых факторов (блокирующие антитела, циркулирующие иммунные комплексы, простагландины Е₂, ИЛ-10, ИЛ-12, γ-интерферона и других).