ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ТРУПНОГО КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ БОРОМ

Засорин Б.В.¹, Мусабаева С.Ж.², Зевалкина Е.В.³, Кеулимжаева А.Е.⁴

¹ORCID: 0000-0002-2418-5957, Доктор медицинских наук, профессор, ²Кандидат медицинских наук, ^3,4Магистр медицины, Западно-Казахстанский государственный медицинский университет

Работа выполнена в рамках НИР №гр. 0113 РК 00986

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ТРУПНОГО КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ БОРОМ

Аннотация

В эксперименте на 80 половозрелых крысах-самцах, с моделью   хронической интоксикации  бором, оценена степень влияния на сперматогенез внутрибрюшинного введения мультипотентных мезинхимальных стромальных клеток, полученных из трупного костного мозга. Установлено, что введение клеточного продукта в ранние сроки (30 дней) повышает процент подвижных спермиев и снижает процент их патологических форм. Показатели осмотической и кислотоустойчивости достигают 50% от нормы. Полученный эффект усиливался в отдалённые сроки (120 дней) после введения клеток и проявлялся нормализацией всех изученных показателей.

Ключевые слова: стромальные клетки костного мозга,  сперматогенез, бор, интоксикация.

Zasorin B.V.¹, Musabaeva S.Zh.², Zevalkina Е.V.³, Keulimzhaeva А.Е.⁴

¹ORCID: 0000-0002-2418-5957, MD, professor, ²MD, ^3,4Мaster of medicine, West Kazakhstan State Medical University

The work was performed as part of reseach №gr. 0113 РК 00986

STUDY OF EFFICIENCY OF STROMAL CELLS OF CADAVERIC BONE MARROW OF CHRONIC INTOXICATION WITH BORON

Abstract

In their experiment, conducted on 80 adult male rats, with a model of chronic intoxication with boron, authors estimated the impact of intraperitoneal introduction of multipotent mesenchymal stromal cells on spermatogenesis (cells are obtained from cadaveric bone marrow). The introduction of cell products in the early period (30 days) increased the percentage of motile sperm and reduced the percentage of pathological forms. Indicators of osmotic and acid resistance were up to 50% of normal value. The effect is amplified in the remote time (120 days) after introduction of the cells and has shown the normalization of all parameters studied.

Keywords: stromal cells of bone marrow, spermatogenesis, boron, intoxication.

В последние годы во всём мире  отчётливо проявляются тревожные  неуклонного роста числа хронических заболеваний и инвалидизации людей трудоспособного возраста.  Данное обстоятельство во многом обусловлено  возрастающей антропогенной нагрузкой на людей различных возрастов, что приводит к нарушениям здоровья, обусловленным экологическими факторами и росту числа хронических интоксикаций различной природы. В результате этого происходит отягощение течения и ухудшение прогноза большинство соматических заболеваний.  Затраты на лечение, реабилитацию и социальную поддержку такого контингента больных ложатся тяжёлым бременем на  государственный бюджет и поглощают значительную часть средств, ежегодно выделяемых на здравоохранение [1].

Современное развитие биотехнологии, молекулярной  и клеточной биологии позволило наряду с химическими способами коррекции метаболизма в повреждённых внешними факторами клетках перейти к использованию  биологических способов, при которых  средством восстановления  функции повреждённых органов и тканей при многих заболеваниях становятся донорские клетки. Это привело к тому, что появилось большое число источников получения клеточного материала (фетальная ткань, клетки костного мозга, экстракты клеток из жировой ткани, амниотической жидкости и т.д.) [2, 3].  Однако вопросам  коррекции нарушений, обусловленных неблагоприятным воздействием химических  факторов окружающей среды, уделяется необоснованно  малое внимание (менее 1%). В то же время  известно, что факторы антропогенной природы являются во многих случаях причиной развития заболеваний эндокринной системы, почек и печени, онкологических заболеваний и т.д. [4].  Одним из таких химических веществ является бор и его соединения. К свойствам бора относятся выраженное гонадотоксическое действие и нарушение сексуальной активности у мужчин, что приводит к нарушению репродуктивной функции [5].

Цель – изучить терапевтическую эффективность аллогенных мезинхимальных стромальных клеток трупного костного мозга для коррекции сперматогенеза после хронического отравления бором.

Материалы и методы. Эксперимент проведен на 80 половозрелых крысах-самцах линии Вистар, массой 200 - 220 г, полученных из питомника п.Светлые горы Московской области, содержащихся в условиях вивария на стандартных кормах. Все манипуляции с животными проводили с соблюдением этических норм работы с лабораторными животными. В исследовании соблюдались: «Правила лабораторной практики в Российской Федерации» утверждённые приказом МЗ РФ №708н от 23.08.10 и Европейской конвенции «Directive 2010/63/EU 22 September 2010».

Модель хронической интоксикации бором воспроизводилась у 60  крыс путём дачи вместе с питьевой водой, на протяжении 60 дней, раствора тетрабората натрия из расчёта 20 мг/кг бора. После окончания затравки животные были разделены на две группы: опытная, получавшая клеточную терапию, и контрольную. Аллогенные мультипотентные мезинхимальные стромальные клетки (ММСК) выделялись из бедренной кости 5 крыс в возрасте 3 месяца, забитых под эфирным наркозом методом декапитации и находившихся при температуре 0ºС в течение 7 дней. Забор костного мозга осуществлялся в соответствии со стандартными операционными процедурами разработанными ранее [6]. Выделенные клетки культивировались в условиях in vitro до шестого пассажа, иммунофенотипировались и использовались в эксперименте. Введение ММСК животным опытной группы осуществлялось внутрибрюшинно, в объёме 1,0 мл с концентрацией стромальных клеток 2х10⁶ кл/мл. Для оценки функционального состояния семенников определяли концентрацию, подвижность и морфологию сперматазоидов, полученных из хвостовой части эпидидимиса по методике Е.К.Миловановой в модификации Г.И.Егоровой. Кроме того, определяли осмотическую и кислотоустойчивость сперматозоидов. Учёт результатов осуществляли через 15, 30 и 120 дней после введения ММСК. Интактным контролем служили 15 животных.

Результаты исследования. Полученные результаты по оценке концентрации сперматозоидов за период исследования представлены на рисунке 1.

Как видно из приведенных на рисунке данных, в ранние сроки (до 30 дней) после введения ММСК достоверных изменений концентрации сперматозоидов в исследуемых группах не произошло.  При этом следует отметить, что количество спермиев в опытной и контрольной группах находилось на уровне в 3 раза меньше, чем у интактных животных. В отдалённые сроки (120 дней) после введения клеток данный показатель соответствует параметрам интактных животных (10,3+1,9 и 12,5+1,3 10⁶мл соответственно). В контрольной группе количество сперматозоидов оставалось на начальном уровне.

Рис. 1 - Динамика изменения концентрации сперматозоидов (млн/мл)

Динамика изменений процента подвижных форм сперматозоидов представлена на рисунке 2.

Установлено, что в опытной группе процент подвижных сперматозоидов достоверно повышается и отличается от показателя контрольной группы (21,63+1,1% и 11,8+1,2% - p<0,05)  через 15дней после введения клеток. Однако, по сравнению с исходными данными,  различий не выявлено. Через 30 дней  после введения ММСК процент подвижных сперматозоидов у животных опытной группы  в 3 раза превышает показатели, как контрольной группы, так и исходные данные, и достигает величин интактных животных.

Полученный результат сохраняется и через 120 дней после введения ММСК.

При этом следует отметить, что в контрольной группе в этот период наблюдается тенденция к увеличению процента подвижных сперматозоидов, но его уровень остаётся в 2 раза ниже, чем в опытной группе.

Данные о динамике изменения процента патологических форм сперматозоидов представлены на рисунке 3.

Рис.  2 - Динамика изменения процента подвижных сперматозоидов

Рис. 3 - Динамика изменения процента патологических форм сперматозоидов

Через 15 дней, после введения ММСК, у животных опытной группы процент патологических форм сперматозоидов снижается и достоверно отличается как от исходных данных (21,63+1,9% и 38,33+2,7%, p<0,05), так и показателей контрольной группы (21,63+1,9% и 40,03+2,6%, p<0,05). Через 30 дней наблюдается та же картина.

В то же время, через 120 дней, процент патологически изменённых сперматозоидов практически соответствуют показателям у животных интактной группы. В то время как, у животных опытной группы данный показатель практически не меняется.

Наряду с функциональными показателями сперматогенеза были изучены адаптивные свойства сперматозоидов в тестах на осмотическую резистентность (%  NaCl) и кислотоустойчивость (рН NaCl) таблица 1.

 

Таблица 1 - Динамика изменения осморезистентности и кислотоустойчивости сперматозоидов

Группы		Осморезистентность	Кислотоустойчивость
Интактные		4,0+0,07	3,2+0,09
Опыт	Исходные	1,6+0,06	0,9+0,07
	15-е сутки	1,8+0,07	1,1+0,09
	30-е сутки	2,2+0,05	1,6+0,09
	120-е сутки	3,9+0,07	3,3+0,06
Контроль	Исходные	1,6+0,06	0,9+0,07
	15-е сутки	1,9+0,09	1,0+0,07
	30-е сутки	1,7+0,06	1,2+0,07
	120-е сутки	2,3+0,08	1,8+0,07

 

Представленные в таблице результаты анализов показывают, что в ранние сроки после введения ММСК не происходит достоверных изменений изученных показателей по отношению к исходным данным. Однако при оценке отдалённых результатов (120 дней) установлена чёткая тенденция к их нормализации. В частности, абсолютные значения изученных параметров в опытной группе равны таковым у интактных животных, но при этом достоверно не отличаются от значений исходных данных.

Обсуждение полученных данных.  Комплексный анализ полученных данных показал, что применение ММСК, выделенных  из трупного костного мозга,  позволяет улучшить функциональные показатели сперматогенеза у  крыс с хроническим отравлением бором. На 15 сутки происходит увеличение процента подвижных спермиев в 3,3 раза по отношению к исходным показателям и в 1,6 раза по сравнению с контролем. Аналогичная  картина наблюдается и при анализе процента патологически изменённых форм сперматозоидов. Их количество в 1,8 раза меньше в опытной группе при сравнении с исходными показателями и 1,95 раза по отношению к контролю. Особо следует подчеркнуть, что позитивный эффект проявляется через 15 дней после введения ММСК и сохраняется на протяжении 1 месяца. В отдалённом периоде, через 120 дней, происходит полная нормализация функциональных показателей сперматогенеза (число сперматозоидов в мл, подвижность спермиев, наличие патологически изменённых форм). Однако их адаптивные возможности (осморезистентность и кислотоустойчивость) восстанавливаются не полностью, хотя и имеют чёткую тенденцию к нормализации.

Результаты проведенных исследований позволяют утверждать, что ММСК, полученные из трупного костного мозга, наряду с другими клеточными продуктами [7, 8], могут быть использованы для   коррекции  нарушений функционального состояния сперматогенеза при хронической интоксикации соединениями бора.

Список литературы / References

1. Ермуханова Л.С., Борщук Е.Л., Верещагин А.И.,Порваткин Р.Б., Боев М.В. Состояние и динамика изменения факторов среды обитания в районах нефтедобычи Оренбургской области. // Здоровье населения и среда обитания. - №11 (248). – 2013. – С. 19-22.
2. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций / под ред. В.А.Шумакова и Н.А.Онищенко. – М.: Лавр.; 2009 – 308 с.
3. Клеточная терапия / под ред. Ю.Л.Шевченко. – М.: МИА.; 2008 – 240 с.
4. Засорин Б.В., Курмангалиев О.М., Насиров И.Н., Белышев А.А., Абрешева Д.Ш. Экспериментальная оценка эффективности применения эмбрионально-клеточного «коктейля» при токсических формах нарушения сперматогенеза. // Медицинский журнал Западного Казахстана – 2010 - №3(27). – С.58 – 62.
5. El-Dakdoky MH,Abd El-Wahab HM. Impact of boric acid exposure at different concentrations on testicular DNA and male rats fertility. // Toxicol Mech Methods.2013 Jun;23(5):360-7.
6. Засорин Б.В., Курмангалиев О.М., Насиров И.Н., Гебель В.В. Оценка эффективности применения мультипотентных мезинхимальных клеток костного мозга для коррекции нарушений функции почек при остром отравлении. // Морфологические ведомости, 2013, №3, С. 43-45.
7. Засорин Б.В., Курмангалиев О.М., Насиров И.Н. Экспериментальная оценка применения мезинхимальных стромальных клеток аллогенного костного мозга для коррекции возрастных изменений. // Международный научно-исследовательский журнал, 2015, №8(39), ч.3 – С. 106 – 109.
8. Hodgetts SI, Stagg K, Sturm M, Edel M, Blancafort P. Long live thestem cell: the use ofstem cells isolated from post mortem tissues for translational strategies. // Int J Biochem Cell Biol. 2014 Nov;56:74-81.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Ermuhanova L.S., Borshhuk E.L., Vereshhagin A.I., Porvatkin R.B., Boev M.V. Sostojanie i dinamika izmenenija faktorov sredy obitanija v rajonah neftedobychi Orenburgskoj oblasti [State and dynamics of changes in the environmental factors in the areas of oil production in Orenburg region]. // Zdorov'e naselenija i sreda obitanija. [Public health and environment]. - №11 (248). - 2013. - P. 19-22. [in Russian]
2. Biologicheskie rezervy kletok kostnogo mozga i korrekcija organnyh disfunkcij [Biological reserves of bone marrow cells and correction of organ dysfunction] / pod red. V.A.Shumakova i N.A.Onishhenko. ed. [V.A.Shumakova and N.A.Onischenko]. - M .: Laurel .; 2009 - 308 p. [in Russian]
3. Kletochnaja terapija [Cell therapy] / pod red. Ju.L.Shevchenko. ed. [Yu.L.Shevchenko].- M .: MIA .; 2008 - 240 p. [in Russian]
4. Zasorin B.V. Kurmangaliyev O.M., Nasirov I.N., Belyshev A.A., Abresheva D.Sh. Jeksperimental'naja ocenka jeffektivnosti primenenija jembrional'no-kletochnogo «koktejlja» pri toksicheskih formah narushenija spermatogeneza [Experimental evaluation of the effectiveness of embryonic cell "cocktail" of toxic forms of spermatogenesis disorders]. // Medicinskij zhurnal Zapadnogo Kazahstana [Medical Journal of West Kazakhstan] - 2010 - №3 (27). - P.58 - 62. [in Russian]
5. El-Dakdoky MH, Abd El-Wahab HM. Impact of boric acid exposure at different concentrations on testicular DNA and male rats fertility. // [Toxicol Mech Methods]. 2013 Jun;23(5):360-7.
6. Zasorin B.V., Kurmangaliyev O.M., Nasirov I.N., Gebel^' V.V. Ocenka jeffektivnosti primenenija mul'tipotentnyh mezinhimal'nyh kletok kostnogo mozga dlja korrekcii narushenij funkcii pochek pri ostrom otravlenii. [Evaluating the effectiveness of multipotent mesenchymal bone marrow cells for correction of renal function in acute poisoning]. //  Morfologicheskie vedomosti [Morphological Gazette], 2013, №3, pp 43-45. [in Russian]
7. Zasorin B.V., Kurmangaliyev O.M., Nasirov I.N. Jeksperimental'naja ocenka primenenija mezinhimal'nyh stromal'nyh kletok allogennogo kostnogo mozga dlja korrekcii vozrastnyh izmenenij. [Experimental evaluation of the application of mesenchymal stromal cells of allogeneic bone marrow for the correction of age-related changes]. // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal [International Research Journal], 2015, №8 (39), part 3 - S. 106 - 109. [in Russian]
8. Hodgetts SI, Stagg K, Sturm M, Edel M, Blancafort P. Long live the stem cell: the use of stem cells isolated from post mortem tissues for translational strategies. // [Int J Biochem Cell Biol]. 2014 Nov;56:74-81.