О СХОДСТВЕ И РАЗЛИЧИИ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА ЭРИТРОЦИТОВ НА МЕХАНИЧЕСКИЙ И СВЕТОВОЙ СТИМУЛЫ

Тимошенко Т. Е.

Кандидат биологических наук, Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

О СХОДСТВЕ И РАЗЛИЧИИ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА ЭРИТРОЦИТОВ НА МЕХАНИЧЕСКИЙ И СВЕТОВОЙ СТИМУЛЫ

Аннотация

В работе проведена экспериментальная проверка выдвинутого ранее автором предположения о сходстве сигнальных путей клеточного ответа эритроцитов на облучение светом с механизмом механотрансдукции в клетках стенки сосудов. Показано, что синтез NO  в эритроцитах после облучения крови in vitro  не изменяется. Результаты обсуждаются.

Ключевые слова: эритроциты, низкоинтенсивный свет, катионные  каналы.

Timoshenko T.E.

Candidate of sciences in Biology, Pavlov Institute of Physiology RAS

ABOUT THE SIMILARITY AND DIFFERENCES BETWEEN THE SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAYS OF RED BLOOD CELLS RESPONSES ON MECHANICAL AND LIGHT STIMULUS

Abstract

In the work made experimental study the assumption about the similarity of signal transduction pathways of red blood cells response on light with mechanism a mechanotransduction in the vascular walls cells. Shown that the synthesis of NO  by erythrocytes after blood laser irradiation in vitro does not change. Results are discussed.

Keywords: erythrocytes, low intensity laser light, cation channels.

В последнее время появилось много новых данных о природе механосенситивности клеток сердечно-сосудистой системы [1]. Представлены убедительные доказательства участия в сократительном ответе гладкомышечных клеток сосудов (ГМК) на растяжение (эффект Бейлиса) неселективных катионных TRP каналов [2] Впервые TRP каналы были идентифицированы у Drosophila m. в качестве активируемых светом каналов. Ген и белок им кодируемый назвали transient receptor potential – TRP. Первый TRP канал млекопитающих был клонирован в 1995 г. и с тех пор описано уже 6 подсемейств белков сходной аминокислотной последовательности с разными свойствами и широким спектром действия, экспрессируемых различными типами клеток, в том числе эндотелием и ГМК. Обнаружено, что отдельные члены суперсемейства TRP белков синтезируются и в клетках крови (TRPC, TRPM) при гемопоэзе [3]. Показана важная роль TRP каналов в регуляции объема эритроцитов [4]. Сначала  сложилось представление о непосредственной stretch-зависимой активации механочувствительных TRP каналов, но теперь получено много доказательств участия в этом процессе рецепторов, связанных с G белками (GPCR), причем активация этих рецепторов механическим стимулом происходит независимо от воздействия их агонистов. Механически активированный рецептор приобретает конформацию, обеспечивающую продуктивную связь с G белком и открытие катионных TRP каналов по зависимому от фосфолипазы С сигнальному пути [5]. Очень похожим сигнальным каскадом обеспечивается активация TRP каналов светом в зрительной системе беспозвоночных [6]. В свете этих работ получают объяснение  имеющиеся в литературе и не понятные до сих пор данные, в том числе и наши собственные, относительно активирующего влияния низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на микроциркуляцию, причем не только на диаметр резистивных сосудов [7], но и на клетки крови [8]. Дело в том, что  к семейству GPCR относятся и родопсиноподобные рецепторы и сам родопсин. В мембране эритроцитов одним из таких рецепторов является  β-адренорецептор и он обладает  структурой, гомологичной родопсину [9]. Относительно родопсина сетчатки позвоночных показано, что его молекула чувствительна к изменению конфигурации и протонированию своей хромофорной составляющей ретиналя, и этот же механизм может работать и в других GPCR [10]. Исходя из сказанного выше, мы предприняли попытку доказать или опровергнуть выдвинутый нами ранее  тезис о том, что влияние на живые эритроциты облучения красным лазерным светом in vitro может осуществляться по типу механотрансдукции [11]. Это представлялось тем более вероятным, что  по нашим данным  в облученной НИЛИ крови достоверно снижается концентрация катионов Na+ и Ca²+ (соответственно должна расти их внутриклеточная концентрация) и увеличивается средний клеточный объем эритроцитов, и этот ответ зависел от степени оксигенации крови [8]. Кроме того, показано, что на увеличение напряжения сдвига эритроциты реагируют увеличением деформируемости  цитоскелета, а у животных, накаутированных по  родопсиноподобным GPCR эта реакция не выражена и развивается анемия [12].

Поэтому мы решили проверить влияние облучения  крови красным светом  с длиной волны 650 нм на активность NO-синтазы в эритроцитах.

В опытах на 10 крысах самцах линии Sprague Dawley, наркотизированных уретаном 1,2 г/кг, производили забор крови из брюшной аорты. Гепаринизированную кровь в разведении 1:10 инкубировали в физиологическом растворе с NO-реактивным флуоресцентным красителем – 5,6 диаминофлуоресцин диацетат - 4,5 µМ (Sigma) в течение 1 часа при температуре 37°С и непрерывном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Затем промывали физиологическим раствором и после оседания суспензию эритроцитов снова разводили 1мМ изотоническим раствором L-аргинина. Каплю этого раствора  помещали между герметично пригнанными стеклами на термостатированном (t=37°C) предметном столе лазерного сканирующего микроскопа LSM-710 (Carl Zeiss, Germany). Для наблюдения флуоресценции красителя в области эмиссии 510-550 нм использовали возбуждающий свет с длиной волны 490 нм. После получения контрольных снимков кровь облучали непосредственно на предметном столе  красным светом диодного излучателя с длиной волны 650 нм  и мощностью излучения 35 мВт в течение 30 минут. Результаты показаны на рисунке. На представленных микрофотографиях видно, что интенсивная флуоресценция красителя, которая, как принято считать, отражает  внутриклеточную концентрацию NO, наблюдается только в отдельных клетках. С целью наблюдения большего количества клеток в поле микроскопа было выбрано небольшое увеличение (объектив х63). После облучения красным НИЛИ клеточные формы эритроцитов становятся более разнообразными, больше клеток правильной дискоидной формы, хотя при данном увеличении трудно говорить об изменении объема. Однако, хорошо видно, что интенсивность флуоресценции остается неизменной. Об этом свидетельствуют и гистограммы распределения амплитуды свечения по частотам, которые позволяет получить программа обработки изображений микроскопа. Интенсивность флуоресценции красителя не изменялась во всех проведенных экспериментах (Рис.)

Рис.1 - Эритроциты крысы слева в контроле, справа – после облучения красным лазерным светом (650 нм, 35 мВт, 30 мин). Поле 67х67 мкм. В центре две флуоресцирующие клетки. Их количество после  облучения не изменилось

Полученные результаты позволяют говорить о том, что, во-первых, влияние НИЛИ на кровь, по-видимому, не может быть опосредовано активацией NO-синтазы. Известно, что такие сигнальные каскады в эритроцитах существуют и зависят от повышения внутриклеточной концентрации Ca²+, в частности, при действии напряжения сдвига [13]. Следовательно, полной аналогии путей воздействия на эритроциты света и механического стимула нет. Во-вторых, если эластические свойства мембраны эритроцитов, от которых зависит их деформируемость, изменяются после облучения, о чем имеются многочисленные свидетельства, то на роль фоточувствительных сигнальных систем могут претендовать TRP белки, непосредственно связанные с такими GPCR рецепторами, которые могут под воздействием света изменять конформацию подобно другим опсинам. Пока о фоточувствительных GPCR в мембране эритроцитов в литературе сведений нет, но есть указание на возможность существования светочувствительных опсинов в различных  нефоторецептивных тканях позвоночных [14, 15]. Так как ранее было показано, что изменения под действием НИЛИ со стороны объема клетки  наиболее выражены у деоксигенированных эритроцитов, механизмом, ответственным за эти изменения может быть активация TRM7 каналов в мембране эритроцитов. Эти каналы в 3 раза более проницаемы для Na+, чем для Ca²+, играют важную роль в регуляции объема клеток и наиболее активны при аноксии [1]. Очевидно, для получения доказательств их участия требуются дальнейшие исследования с применением активаторов и ингибиторов TRP каналов, а также методов генной инженерии.

Литература

1. J. Folgering, R. Sharif-Naeini, A. Dedman, A. Patel. et al. // Progress in Biophysics and Molecular Biology - 2008. - Vol. 97 - P. 180-195.
2. D.G. Welsh, A. D. Morielli, M. Nelson, J. Brayden // Circ. Res. -2002. - Vol. 90 P. 248-250.
3. B. Minke, B. Cook // Physiol. Rev.-2002. - Vol. 82 - P. 429-472.
4. I.Hirschier-Laszkiewicz, W. Zhang, K. Keefer, K. Conrad et al. // Exp. Hematol.-2012. - Vol. 40, № 1. - P.71-83.
5. M. Mederos, Y. Schnitzler, U. Storch, S. Meibers et al. // The EMBO J. -2008.-Vol. 27, № 23 - P. 3092-3103.
6. B. Minke // J. Neurogenet. - 2010. - Vol. 24, № 4. - P. 216-233.
7. Дворецкий Д. П., Тимошенко Т. Е., Белобокова Н. К. // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. -2004 – Т. 90, № 11 –С. 1356-1369.
8. Тимошенко Т. Е., Дворецкий Д. П. // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова.- 2010 – Т. 96, № 10 – С.998-1004.
9. R. Dixon., I. Rands, R. Register M. Candelore et al. // Nature - 1987 – Vol. 326, № 6108 – P. 73-77.
10. R. Maeda, M. Hiroshima, T. Yamashita, A. Wada et al. // Biophys. J. – 2014 – Vol. 106, № 4 – P. 915-924.
11. Тимошенко Т. Е. // Биология - наука ХХI века. Москва. 2012. С. 932-934.
12. T. Kalfa, S. Pushkaran, N. Mohandas, J. Hartwig et al. //Blood – 2006 – Vol. 108, № 12 – P. 3637-3645.
13. N. Barvitenko, N. Adragna, R. Weber // Cell. Physiol. Biochem. – 2005 - Vol. 15 – P. 1-18.
14. Этингоф Р. Н. // Ж. эволюционной биохимии и физиологии – 1997 – Т. 33, № 4-5 – С. 556-569.
15. M. Koyanagi, E. Takada, T. Nagata, H. Tsukamoto et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 2013 – Vol. 110, № 13 – P. 4998-5003.