ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА И ДОЗИРОВОК ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ПРОЦЕСС ГИДРОЛИЗА ЭКСТРУДИРОВАННОГО ШРОТА ПОДСОЛНЕЧНИКА

Шариков А.Ю.¹, Середа А.С.², Великорецкая И.А.³, Костылева Е.В.⁴, Веселкина Т.Н.⁵

¹ORCID: 0000-0001-9483-5209, кандидат технических наук, ²ORCID: 0000-0001-9097-3946, кандидат технических наук, ³ORCID: 0000-0003-1851-1127, младший научный сотрудник, ⁴ORCID: 0000-0002-4775-303X, кандидат технических наук, ⁵ORCID: 0000-0003-0261-1756, старший научный сотрудник, Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии - филиал ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Исследование проведено в рамках гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых ученых — кандидатов наук МК-5743.2015.4

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА И ДОЗИРОВОК ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ПРОЦЕСС ГИДРОЛИЗА ЭКСТРУДИРОВАННОГО ШРОТА ПОДСОЛНЕЧНИКА

Аннотация

С целью повышения пищевой и кормовой ценности шрота подсолнечника были проведены исследования по его комбинированной биоконверсии с применением термомеханической экструзии и ферментативной обработки препаратами целлюлолитического и протеолитического действия. Методом рототабельного композиционного планирования, в котором управляющими факторами являлись концентрация субстрата и дозировки ферментных препаратов, было установлено, что повышение концентрации сухих веществ в реакционной смеси при гидролизе экструдированного шрота подсолнечника способствует повышению степени гидролиза некрахмальных полисахаридов и затрудняет гидролиз белка до легкоусвояемых растворимых пептидов с молекулярной массой ниже 10 кДа. Максимальные достигнутые концентрации продуктов гидролиза в условиях опыта (12-12,5 мг ВС /г СВ и 245-250 мг растворимого белка/г СВ) соответствовали максимальным дозировкам соответствующих ферментных препаратов. Показано, что экструзионная предподготовка шрота подсолнечника обеспечивает повышение концентрации ВС на 51,5% и растворимого белка на 15,1% по сравнению с гидролизатами неэкструдированного шрота подсолнечниками.

Ключевые слова: шрот подсолнечника, экструзия, гидролиз, протеаза, целлюлаза, концентрация субстрата.

Sharikov A.Yu.¹, Sereda A.S.², Velikoretskaya I.A.³, Kostyleva E.V.⁴, Veselkina T.N.⁵

¹ORCID: 0000-0001-9483-5209, PhD in Engineering, ²ORCID: 0000-0001-9097-3946, PhD in Engineering, ³ORCID: 0000-0003-1851-1127, junior researcher, ⁴ORCID: 0000-0002-4775-303X, PhD in Engineering, ⁵ORCID: 0000-0003-0261-1756, senior researcher, Russian research institute of food biotechnology — branch of Federal Research center of nutrition and biotechnology

EFFECT OF SOLIDS CONCENTRATION AND ENZYMES DOSAGES ON HYDROLYSIS OF EXTRUDED SUNFLOWER MEAL

Abstract

In order to improve the nutritional value of sunflower meal, studies have been conducted on its combined bioconversion using thermomechanical extrusion and enzymatic treatment with cellulolytic and proteolytic preparations. Using the rototable composite planning method, in which managing factors were the substrate concentration and the enzyme preparations dosage, it was found that increasing the solids concentration in the reaction mixture during extruded sunflower meal hydrolysis enhances the degree of hydrolysis of non-starch polysaccharides and hinders hydrolysis of the protein to digestible soluble peptides with a molecular weight below 10 kDa. The maximal achieved concentrations of hydrolysis products in the experiment conditions (12-12.5 mg RS / g DM and 245-250 mg soluble protein / g DM) corresponded to the maximum dosages of appropriate enzyme preparations. It was shown that sunflower meal pretreatment using extrusion provides increased RS concentrations by 51.5% and the soluble protein by 15.1% compared to hydrolysates of the nonextruded sunflower meal.

Key words: sunflower meal, extrusion cooking, hydrolysis, proteases, cellulase, solids concentration.

Введение

Шрот подсолнечника является перспективным сырьевым источником  для пищевой, кормовой и микробиологической отраслей. Белки подсолнечника не содержат антипитательных компонентов, не обладают специфическим вкусом и характеризуются хорошо сбалансированным аминокислотным составом, за исключением лизина, который является лимитирующей кислотой [1]. Использование подсолнечного шрота (ПШ) в кормовых целях ограничено из-за высокого содержания некрахмальных полисахаридов (НКП), оказывающих антипитательное действие. НКП повышают вязкость перевариваемой массы, снижают утилизацию нутриентов, образуют комплексы с белком, снижая его переваримость, способствуют развитию патогенной микрофлоры в кишечнике [2, 3]. Основными НКП подсолнечного шрота являются целлюлоза и арабиноксиланы. В среднем, в семенах подсолнечника общее содержание НКП составляет до 31,2%.

Для снижения антипитательного действия НКП широко применяют ферментативную биоконверсию. Ферментные препараты (ФП) целлюлаз и гемицеллюлаз разрушают матрикс клеточных стенок и повышают доступность питательных компонентов для действия пищеварительных ферментов. Частичный гидролиз НКП повышает содержание простых сахаров, дефицит которых является одной из проблем кормопроизводства. Недостаток простых сахаров в рационе может вызывать целый ряд нарушений обмена веществ животных, снижающих степень использования питательных веществ и их трансформации в продукты животноводства и уменьшающих срок хозяйственного использования животных [4]. Помимо карбогидраз при обработке ПШ используют протеолитические ФП для получения гидролизатов с улучшенными функциональными и питательными свойствами. Гидролизаты белка подсолнечника могут быть источником биоактивных пептидов [5]. Важными технико-экономическими факторами проведения биоконверсии шрота подсолнечника являются концентрация сухих веществ в реакционной среде и дозировки гидролитических ферментных препаратов. Субстрат с высоким содержанием НКП склонен к набуханию, что при водно-ферментативной обработке при высоких концентрациях сухих веществ значительно снижает массообмен, повышает вязкость  среды, затрудняет перемешивание и перекачивание гидролизата с риском образования заторов в технологических трубопроводах.

Целью исследования являлось изучение влияния концентрации сухих веществ и дозировок ФП на качество гидролиза шрота подсолнечника, предварительно подвергнутого термомеханической экструзии — процесса, обеспечивающий доизмельчение сырья, его баро-, влаго- и термообработку в условиях высокого напряжения сдвига [6] и способствующего повышению ферментативной атакуемости биополимеров растительного сырья.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлся шрот подсолнечника тостированный влажностью 7,8% с содержанием белка 39% на абсолютно сухое вещество.

Шрот подсолнечника экструдировали на лабораторном экструдере Werner&Pfleiderer Continua 37 (Штутгарт, Германия) с диаметром шнеков 37 мм и относительной длиной зоны экструзии 27 м/м. Температура экструзии составляла 150 ºС, скорость вращения шнеков 270 об/мин, давление 5,8 МПа.

Гидролиз проэкструдированного шрота осуществляли протеолитическим ферментным препаратом Протолад Б (ОАО «Энзим», Украина) и целлюлолитичеким препаратом Целлюлад (ОАО «Энзим», Украина). Ферментативную обработку субстрата проводили в течение 5 часов при температуре 40 ºС.

Дизайн исследования базировался на методе рототабельного композиционного планирования эксперимента, в котором в качестве управляющих факторов были приняты концентрация реакционной среды и дозировки ферментных препаратов. Уровни варьирования факторов представлены в таблице 1.

 

Таблица 1 — Реальные и кодированные значения управляющих факторов

Кодированные значения	Реальные значения
	Концентрация сухих веществ	Дозировка протеазы	Дозировка целлюлазы
	%	ед.ПС/ г СВ	ед. КМЦ/ г СВ
-α	15,0	0,5	10,0
-1	17,0	0,8	16,0
0	20,0	1,25	25,0
1	23,0	1,7	34,0
α	25,0	2,0	40,0

 

Выходными параметрами эксперимента являлись выход растворимого белка и выход восстанавливающих сахаров (ВС), как косвенный показатель гидролиза некрахмалистых полисахаридов (НКП). Содержание  растворимого белка определяли методом Лоури как концентрацию низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой (М.м.) менее 10 кДа [7], содержание ВС определяли методом Шомоди-Нельсона [8].

Статистическую обработку результатов измерения, выполнение расчетов методом ортогонального композиционного планирования, проверку значимости коэффициентов уравнения по критерию Стьюдента и адекватность модели по критерию Фишера осуществляли с применением программы Scilab 5.5 (Scilab Enterprises, Франция) при уровне значимости α=0,05.

Результаты и их обсуждение

В таблице 2 представлены результаты гидролиза экструдированного шрота подсолнечника.

 

Таблица 2 — Результаты гидролиза

Концентрация сухих веществ	Дозировка протеазы	Дозировка целлюлазы	Концентрация растворимого белка	Концентрация восстанавлива-ющих сахаров
%	ед.ПС/ г СВ	ед. КМЦ/ г СВ	мг/ г СВ	мг/ г СВ
23,0	1,7	34,0	223,0	12,0
17,0	1,7	34,0	251,0	11,0
23,0	0,8	34,0	209,0	13,6
23,0	1,7	16,0	220,0	8,7
17,0	0,8	16,0	198,0	8,1
23,0	0,8	16,0	195,0	10,9
17,0	1,7	16,0	243,0	8,5
17,0	0,8	34,0	211,0	10,9
15,0	1,25	25,0	235,0	8,4
25,0	1,25	25,0	214,0	11,5
20,0	0,5	25,0	189,0	11,2
20,0	2,0	25,0	243,0	12,1
20,0	1,25	10,0	220,0	6,1
20,0	1,25	40,0	237,0	12,0
20,0	1,25	25,0	220,0	10,0
20,0	1,25	25,0	219,0	9,8
20,0	1,25	25,0	220,0	11,3
20,0	1,25	25,0	218,0	11,1
20,0	1,25	25,0	226,0	9,6
20,0	1,25	25,0	223,0	10,7
Контроль (без экструзии)
20,0	1,25	25,0	192	6,6

 

Методом рототабельного композиционного планирования на основании проведенных экспериментальных работ получены адекватные математические модели в виде полиномов второго порядка 1 и 2, описывающих влияние управляющих факторов — концентрации субстрата и дозировок гидролитических ферментных препаратов на концентрацию растворимого белка и восстанавливающих сахаров.

где ph — концентрация растворимого белка, мг/ г СВ; rs - концентрация восстанавливающих сахаров, мг / г СВ; S - концентрация сухих веществ гидролизата, %; p- дозировка протеазы, ед.ПС/ г СВ; z - дозировка целлюлазы, ед. КМЦ/ г СВ; Графическая интерпретация полученных моделей в виде линий равного уровня при фиксированных значениях одного из управляющих факторов представлена на рисунках 1 и 2.

Анализ рисунка 1 показывает, что в исследуемом факторном пространстве максимальное образование восстанавливающих сахаров 12-12,5 мг/ г СВ соответствует высокой концентрации субстрата 21-23% и высокой концентрации целлюлазы 28-34 ед. КМЦ/ г СВ (рисунок 1С, 1D и 1I ). Характер линий равного уровня свидетельствует о положительной корреляции между этими управляющими факторами и концентрацией восстанавливающих сахаров. Низкие значения концентрации субстрата (17-19%) и дозировки целлюлазы (16-20 ед. КМЦ/ г СВ ) обеспечивают гидролиз некрахмалистых полисахаридов до восстанавливающих сахаров на уровне значений 7,5-8 мг/ г СВ. Стоит отметить, что значение контроля — неэкструдированного образца, прогидролизованного при условиях центра рототабельного плана, составило всего 6,6 мг/г СВ. Сравнение со средним значением опыта в центре плана, составляющим 10 мг/ г СВ, свидетельствует о том, что предварительное экструдирование сырья позволило повысить концентрацию восстанавливающих сахаров на 51,5%.

Рис. 1 — Влияние управляющих факторов на изменение концентрации восстанавливающих сахаров при фиксированной концентрации субстрата: А — 17 % СВ, B — 20 % СВ, C — 23 % СВ; при фиксированной дозировке протеазы: D — 0,8 ед. ПС/ г СВ, E — 1,25 ед.ПС/ г СВ, F — 1,7 ед.ПС / г СВ; при фиксированной дозировке целлюлазе: G — 16 ед.КМЦ/г СВ, H — 25 ед.КМЦ/г СВ, I — 34  ед.КМЦ/г СВ

Помимо очевидного влияния концентрации сухих веществ и дозировки целлюлазы, стоит отметить значимое влияние протеазы на результаты гидролиза НКП. При низкой концентрации субстрата (рисунок 1А) увеличение дозировки протеазы совместно с увеличением дозировки целлюлазы способствует повышению содержания восстанавливающих сахаров. В зоне высокой концентрации СВ гидролизата влияние протеазы имеет обратный характер (рисунок 1С, 1D  и 1I ) и максимальным значениям концентрации восстанавливающих сахаров соответствует минимальная дозировка протеазы 0,8-1 ед. ПС/г СВ. Такое влияние протеазы можно связать с эффектом протеолиза белковых молекул целлюлаз, возрастающего в условиях повышения концентрации среды и дозировки протеолитического ФП.

На рисунке 2 в виде линий равного уровня представлена модель влияния исследуемых управляющих факторов на гидролиз белка экструдированного шрота до растворимых фракций. Положительной корреляцией характеризуется зависимость концентрации растворимого белка от дозировок протезы и целлюлазы (рисунок 2А и 2В). Максимальное значение в условиях опыта составляло 245-250 мг/г СВ. Низким значениям дозировки протеазы соответствует концентрация растворимого белка 201-210 мг/ г СВ, что выше, чем в контрольном образце неэкструдированного шрота, гидролиз которого был проведен при более высоких дозировках протеазы. Концентрация растворимого белка отрицательно коррелирует с концентрацией , что хорошо видно на рисунах 2F, 2H и 2I. При этом характер линий равного уровня показывает, что эффект влияния концентрации субстрата на результаты гидролиза возрастает с увеличением дозировки протеазы как показано на рисунках 2G, 2H и 2I.

Рис. 2 — Влияние управляющих факторов на изменение концентрации растворимого белка при фиксированной концентрации субстрата: А — 17 % СВ, B — 20 % СВ, C — 23 % СВ; при фиксированной дозировке протеазы: D — 0,8 ед. ПС/ г СВ, E — 1,25 ед.ПС/ г СВ, F — 1,7 ед.ПС / г СВ; при фиксированной дозировке целлюлазе: G — 16 ед.КМЦ/г СВ, H — 25 ед.КМЦ/г СВ, I — 34  ед.КМЦ/г СВ

Так например, при фиксированной дозировке целлюлазы 34 ед. КМЦ / г СВ и дозировке протеазы 1,4 ед. ПС / г СВ увеличение концентрации СВ реакционной смеси с 17 до 20% вызывает снижение концентрации растворимого белка с 245 до 238 мг/ г СВ. А дальнейшее увеличение до 22,7% уменьшает концентрацию растворимого белка до 231 мг/г СВ, то есть общее снижение в рамках интервала варьирования концентрации гидролизата составляет около 6%.

В случае гидролиза белковой фракции экструдированного шрота подсолнечника в сравнении с неэкструдированным образцом контроля установлено увеличение концентрации растворимого белка с 192 до 221 мг/ г СВ. Таким образом, экструзия в идентичных условиях гидролиза обеспечивает увеличение содержания растворимого белка на 15,1%.

Выводы

По результатам проведенного исследования установлено, что повышение концентрации сухих веществ в реакционной смеси при гидролизе экструдированного шрота подсолнечника повышает качество гидролиза некрахмальных полисахаридов и снижает уровень гидролиза белка. Максимально достигнутые концентрации продуктов гидролиза в условиях опыта составляли 12-12,5 мг ВС /г СВ и 245-250 мг растворимого белка/ г СВ  соответствовали максимальным дозировкам используемых ферментных препаратов. При этом максимальные значения концентрации восстанавливающих сахаров отмечены для минимальных дозировок протеазы, что может быть вызвано частичным гидролизом целлюлолитического ФП в условиях повышения дозировки протеолитического ФП. Увеличение концентрации целлюлазы в комплексе с протеазой оказывает положительный эффект на гидролиз белка.

Сравнение результатов опыта с контрольным образцом прогидролизованного неэкструдированного сырья показало, что экструзионная предподготовка шрота подсолнечника обеспечивает повышение концентрации ВС на 51,5%, а растворимого белка на 15,1%.

Список литературы / References

1. Sredanovic S.A. The nutritive value of poultry diets containing sunflower meal supplemented by enzymes / S.A. Sredanovic, J.D. Levića, R.D. Jovanovic, O.M. Duragić // Acta periodica technologica.- 2012. - V.43- P. 79-91.
2. Amerah A.M. Effect of different levels of rapeseed meal and sunflower meal and enzyme combination on the performance, digesta viscosity and carcass traits of broiler chickens fed wheat-based diets/ A.M. Amerah, K. van de Belt, J.D. van Der Klis // Animal. -2015.- V.9. - P.1131-1137.
3. Sredanovic S. Enzyme enhancement of the nutritional value of sunflower meal / S. Sredanovic, J. Levic, O. Djuragic// Biotechnology in Animal Husbandry.- 2005.-V.21. -P.197-202.
4. Забудский Ю.И. Зоогигиена с основами проектирования животноводческих объектов Электронный учебно-методический комплекс / Ю.И. Забудский, Р.А. Камалов, И.И. Кочиш М.: ФГОУ ВПО РГАЗУ и ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина.-2008.- URL: https://goo.gl/mKpz40
5. Characterization of sunflower seed and kernel proteins/ S Žilić, M Barać, M Pešić, M Crevar, S Stanojević, A Nišavić, G Saratlić, M Tolimir// HELIA.- 2010. V.33, N52.- P.103-114.
6. Lamsal B. Extrusion as a thermo-mechanical pre-treatment for lignocellulosic ethanol / B. Lamsal, J. Yoo, K. Brijwani, S. Alavi // Biomass and Bioenergy. 2010. - №12. - P.1703-1710.
7. Morais H.A. Correlation between the degree of hydrolysis and the peptide profile of whey protein concentrate hydrolysates: effect of the enzyme type and reaction time / H.A. Morais, M.P.C. Silvestre, V.D.M. Silva , M.R. Silva, A.C. Simoes e Silva, J.N. Silveira// American Journal of Food Technology.- 2013.- №8. P.1-16.
8. Синицын А.П. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов /А.П. Синицын, В.М. Черноглазов, А.В. Гусаков // Биотехнология. (Итоги развития науки и техники АН СССР). М., 1990. Вып. 25. С. 152.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Sredanovic S.A. The nutritive value of poultry diets containing sunflower meal supplemented by enzymes / S.A. Sredanovic, J.D. Levića, R.D. Jovanovic, O.M. Duragić // Acta periodica technologica.- 2012. - V.43- P. 79-91.
2. Amerah A.M. Effect of different levels of rapeseed meal and sunflower meal and enzyme combination on the performance, digesta viscosity and carcass traits of broiler chickens fed wheat-based diets/ A.M. Amerah, K. van de Belt, J.D. van Der Klis // Animal. -2015.- V.9. - P.1131-1137.
3. Sredanovic S. Enzyme enhancement of the nutritional value of sunflower meal / S. Sredanovic, J. Levic, O. Djuragic// Biotechnology in Animal Husbandry.- 2005.-V.21. -P.197-202.
4. Zabudskiy Yu.I. Zoogigiena s osnovami proetirovaniya zhivotnovodcheskih obektov. [Zoohygiene with the basics of designing of the livestock facilities. Electronic teaching couresesmplex]/ Yu.I. Zabudskiy, R.A. Kamalov, I.I. Kochish . - M.- 2008.-URL: https://goo.gl/mKpz40 [in Russian]
5. Characterization of sunflower seed and kernel proteins/ S Žilić, M Barać, M Pešić, M Crevar, S Stanojević, A Nišavić, G Saratlić, M Tolimir// HELIA.- 2010. V.33, N52.- P.103-114.
6. Lamsal B. Extrusion as a thermo-mechanical pre-treatment for lignocellulosic ethanol / B. Lamsal, J. Yoo, K. Brijwani, S. Alavi // Biomass and Bioenergy. 2010. - №12. - P.1703-1710.
7. Morais H.A. Correlation between the degree of hydrolysis and the peptide profile of whey protein concentrate hydrolysates: effect of the enzyme type and reaction time / H.A. Morais, M.P.C. Silvestre, V.D.M. Silva , M.R. Silva, A.C. Simoes e Silva, J.N. Silveira// American Journal of Food Technology.- 2013.- №8. P.1-16.
8. Sinitsyn A.P. Methody izucheniya i svoistva celluloliticheskich fermentov [Methods of investigation of cellulolytic enzymes and its properties]/ A.P. Sinitsyn, V.M. Chernoglazov, A.V. Gusakov // Biotechnology. (Results of Research and Technology. Academy of Sciences of the USSR). M., 1990. Is.25. 152 P. [in Russian]