КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ ГИДРОКСИКОРИЧНЫХ КИСЛОТ В ТРАВЕ БУКВИЦЫ
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ ГИДРОКСИКОРИЧНЫХ КИСЛОТ В ТРАВЕ БУКВИЦЫ
Аннотация
Объектом исследования служила трава буквицы, выращенная в ботаническом саду им. И.И. Спрыгина Пензенского государственного университета. Сырьё было высушено на воздухе без доступа прямых солнечных лучей. Для идентификации гидроксикоричных кислот в траве буквицы использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ). Методом прямой спектрофотометрии в извлечениях из травы буквицы подтверждено наличие гидроксикоричных кислот, определены аналитические максимумы исследуемых соединений (330±2 нм). Обоснованы оптимальные условия экстракции фенилпропаноидов из сырья:
- экстрагент — спирт этиловый 40%;
- соотношение «сырьё — экстрагент» — 1:200;
- время экстракции — 30 минут;
- степень измельчения сырья — 1,0 мм.
Цель исследования — идентификация и количественное определение суммы гидроксикоричных кислот в траве буквицы. Проведена метрологическая оценка методики определения суммы гидроксикоричных кислот.
1. Введение
Высокий интерес к гидроксикоричным кислотам (ГКК) обусловлен их широким спектром фармакологической активности и низкой токсичностью , , что стимулирует поиск новых растительных источников этих ценных соединений. Буквица лекарственная (Betonica officinalis L.) представляет собой перспективный источник HCA, а также других биологически активных веществ.
Химический состав буквицы лекарственной достаточно разнообразен и включает эфирные масла (с преобладанием -мууролена, -кариофиллена, бензальдегида и фитола), флавоноиды (ориентин, лютеолин-7-глюкозид, апигенин-7-глюкозид, апигенин-3-глюкозид, апигенин, цинарозид), гидроксикоричные кислоты (хлорогеновая, феруловая, кофейная и розмариновая кислоты), жирные кислоты (линолевая и линоленовая), а также дубильные вещества и сапонины. Такое разнообразие состава обуславливает широкий спектр фармакологических свойств этого растения , .
Буквица лекарственная — это многолетнее травянистое растение, широко распространенное в Европе (за исключением северных и средиземноморских регионов), Западной Сибири, на Кавказе, в Северной Анатолии и северо-западной Африке, произрастающее на высоте до 450 метров над уровнем моря.
Для стандартизации лекарственного растительного сырья и успешного внедрения травы буквицы в медицинскую практику необходимо разработать воспроизводимые методики качественного и количественного анализа, выбрать оптимальные методы (например, cпектрофотометрию), оптимизировать условия экстракции и установить четкие показатели качества. Важным этапом является разработка соответствующей нормативной документации.
Одним из наиболее распространенных методов количественного определения ГКК является прямая спектрофотометрия, широко используемая как зарубежными, так и отечественными исследователями ,,, . В соответствии с требованиями Государственной фармакопеи XV издания, для идентификации ГКК рекомендована тонкослойная хроматография, а для количественного определения — спектрофотометрический метод .
В медицине буквица лекарственная используется благодаря ее вяжущим, противовоспалительным, противогеморрагическим, противоревматическим, цитотоксическим и противогрибковым свойствам. Показаниями к применению являются гастроинтестинальные расстройства, нервные заболевания, воспаления полости рта и горла, заболевания верхних дыхательных путей, кашель, мигрень и инфицированные раны , . Однако в настоящий момент не разработана нормативная документация и данное сырье не включено в государственную фармакопею.
2. Методы и принципы исследования
Для подтверждения присутствия гидроксикоричных кислот в траве буквицы использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ)
, . Методика идентификации гидроксикоричных кислот методом ТСХ: подготовка пластинки (хроматографическая пластинка активируется в сушильном шкафу при температуре 100–105°С, наносится линия старта и происходит нанесение проб). На линию старта наносится 0,02 мкл водно-спиртового извлечения из травы буквицы и параллельно наносятся стандартные образцы: лютеолин-7-глюкозид, кофейная кислота, хлорогеновая кислота, рутин, гиперозид, кверцетин. Условия хроматографирования: система растворителей: хлороформ — этиловый спирт 70% — вода (26:16:3), тип хроматографирования: восходящий, пластинка: «Сорбфил-ПТСХ-АФ-Ф-УФ», камера предварительно насыщается парами растворителей в течение 24 часов, процесс продолжается до прохождения фронта растворителя на 8 см. Принципы детектирования: визуальный осмотр при дневном свете, просмотр в УФ-свете при λ=366 нм, просмотр в УФ-свете при λ=254 нм, обработка щелочным раствором ДСК, обработка фосфорно-молибденовой кислотой. Данная методика позволяет достоверно идентифицировать наличие гидроксикоричных кислот в исследуемом сырье благодаря использованию стандартных образцов и многоступенчатому процессу детектирования , , .Разработанный способ предназначен для эффективного извлечения и количественного определения содержания гидроксикоричных кислот (ГКК) в траве Betonica officinalis с целью оценки качества лекарственного растительного сырья. Метод базируется на разовой экстракции ГКК этанолом различной концентрации (95%, 70% и 40%) с последующей термообработкой на кипящей водяной бане в течение получаса. Количественный анализ осуществляют спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-102, фиксируя оптическую плотность спиртового извлечения при длине волны 330 нм. Точную массу (1,0 г) размельченного растительного материала помещают в колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой. К подготовленному сырью прибавляют 200 мл выбранного растворителя - этанола необходимой концентрации. После охлаждения полученный экстракт процеживают через бумажный фильтр, предварительно увлажненный тем же спиртом. Первые 10 мл отфильтрованного раствора не используют (полученный раствор именуют как раствор А). В мерную колбу объемом 50 мл вносят 1,0 мл раствора А и доводят объем до необходимой отметки тем же растворителем (полученный раствор определяется как раствор Б). В роли раствора сравнения выступает чистый этанол соответствующей концентрации. Количество суммарных гидроксикоричных кислот рассчитывали, используя формулу (1):
где, D — оптическая плотность испытуемого раствора;
m — масса сырья, г;
W — потеря в массе при высушивании сырья (влажность), %;
497 — удельный показатель поглощения хлорогеновой кислоты при 330 нм.
3. Основные результаты и обсуждение
Результаты хроматографического анализа показали следующие данные: оранжевое пятно с Rf = 0,53 (совпадает с СО хлорогеновой кислотой), желтое пятно с Rf = 0,62 (совпадает с СО лютеолин-7-глюкозидом). Рекомендации по проведению качественного анализа: использовать хлорогеновую кислоту в качестве вещества-стандарта и производить расчет значений Rf для подтверждения идентичности компонентов. Методологические особенности: сравнение Rf исследуемых веществ с Rf стандартных образцов позволяет достоверно идентифицировать компоненты. Наличие характерных цветов пятен (оранжевый и желтый) дополнительно подтверждает идентификацию. Такой подход к анализу позволяет: достоверно идентифицировать присутствующие компоненты, подтвердить качество исследуемого сырья, обеспечить воспроизводимость результатов анализа. Использование хлорогеновой кислоты как стандартного образца особенно рационально, так как она является одним из основных компонентов в исследуемом материале и имеет характерные показатели Rf и цвет пятна.
Рисунок 1 - Схема хроматограммы извлечения из травы буквицы
Рисунок 2 - Электронный спектр стандартного образца хлорогеновой кислоты (2) и извлечения из надземной части Betonica officinalis (1)
Таблица 1 - Зависимость выхода гидроксикоричных кислот травы буквицы от концентрации экстрагента
Концентрация экстрагента | Содержание суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на абсолютно сухое сырье и хлорогеновую кислоту, % |
Этанол 20% | 1,62±0,11 |
Этанол 40% | 3,31±0,08 |
Этанол 70% | 3,08±0,09 |
Этанол 95% | 2,02±0,08 |
Таблица 2 - Зависимость выхода гидроксикоричных кислот от времени извлечения на кипящей водяной бане
Время настаивания на кипящей водяной бане, мин | Содержание суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на абсолютно сухое сырье и хлорогеновую кислоту, % |
15 | 3,11±0,12 |
30 | 3,48±0,09 |
60 | 3,22±0,07 |
90 | 3,11±0,08 |
Таблица 3 - Зависимость выхода гидроксикоричных кислот от соотношения «сырье-экстрагент»
Соотношение «сырье-экстрагент» | Содержание суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на абсолютно сухое сырье и хлорогеновую кислоту, % |
1:100 | 3,20±0,06 |
1:200 | 3,48±0,09 |
1:300 | 3,29±0,07 |
Размер частиц 1 мм обеспечивает оптимальную поверхность контакта сырья с экстрагентом, 40% этиловый спирт является оптимальным растворителем для извлечения гидроксикоричных кислот, соотношение 1:200 гарантирует достаточное количество экстрагента для максимального извлечения, 30-минутная экстракция обеспечивает полное извлечение компонентов при температуре 90°C, данная температура ускоряет процесс экстракции без разрушения термолабильных компонентов. Необходимо тщательно измельчать сырье до однородного состояния и соблюдать точное соотношение сырья и экстрагента, контролировать температуру водяной бани, обеспечивать равномерное перемешивание. Данная методика позволяет получить максимально полное извлечение гидроксикоричных кислотиз травы буквицы при сохранении их качественных характеристик. Она может быть рекомендована для анализа и контроля качества растительного сырья.
Выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции, так как происходит минимизация ошибок при пробоподготовке, сокращение времени анализа, простота выполнения процедуры, уменьшение потерь аналитика, повышение воспроизводимости результатов.
Выявлено, что содержание гидроксикоричных кислот, при использовании в качестве экстрагента этанола 40% составляет 3,46%.
Проведена метрологическая оценка методики определения суммы гидроксикоричных кислот
. В результате пяти параллельных определений (Хср= 3,48) установлена дисперсия (S2 = 0,005), стандартное отклонение (S = 0,074), стандартное отклонение среднего результата (SXср = 0,033), относительное стандартное отклонение среднего результата (RSD = 2,13%), полуширина доверительного интервала (ΔХср = 0,092). Погрешность среднего результата (ε, %) суммы гидроксикоричных кислот с доверительной вероятностью (Р,%) 95% в сырье буквицы лекарственной составила ±2,74 %, в пересчете на хлорогеновую кислоту.4. Заключение
В результате исследования подтверждено наличие хлорогеновой кислоты методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). В рамках исследования разработана и валидирована методика количественного определения суммы ГКК в растительном сырье, основанная на принципе прямой спектрофотометрии при длине волны 330 нм. Количественный анализ проводился с использованием хлорогеновой кислоты в качестве стандарта. Для достижения максимального выхода ГКК были оптимизированы параметры экстракции:
- размер частиц сырья: 1 мм;
- экстрагирующий агент: 40% водный раствор этанола;
- соотношение «сырье/экстрагент»: 1:200 (г/мл);
- продолжительность экстракции: 30 минут;
- температура экстракции: кипящая водяная баня.
Применение разработанной методики к исследованному образцу позволило установить содержание ГКК на уровне 3,46% в пересчете на хлорогеновую кислоту. Полученные результаты свидетельствуют о пригодности разработанной методики для рутинного количественного определения содержания ГКК в растительных материалах. Методика может быть рекомендована для использования при разработке фармакопейных статей и другой нормативной документации, направленной на стандартизацию новых видов лекарственного растительного сырья, содержащего гидроксикоричные кислоты, поскольку обеспечивает надежное и воспроизводимое определение.