ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ SCD1 (СТЕРОЛ-КoA ДЕСАТУРАЗА) И AGPAT6 (1-АЦИЛГЛИЦЕРИН-3-ФОСФАТ-O-АЦИЛТРАНСФЕРАЗА) НА СОДЕРЖАНИЕ И ЖИРНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ МОЛОЧНОГО ЖИРА У КОРОВ ГОЛШТИНИЗИРОВАННОЙ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОДЫ
ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ SCD1 (СТЕРОЛ-КoA ДЕСАТУРАЗА) И AGPAT6 (1-АЦИЛГЛИЦЕРИН-3-ФОСФАТ-O-АЦИЛТРАНСФЕРАЗА) НА СОДЕРЖАНИЕ И ЖИРНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ МОЛОЧНОГО ЖИРА У КОРОВ ГОЛШТИНИЗИРОВАННОЙ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОДЫ
Аннотация
Целью данной работы была оценка частот встречаемости аллельных полиморфизмов генов SCD1 (Стерол-КoA десатураза) и AGPAT6 (1-Ацилглицерин-3-фосфат-O-ацилтрансфераза) и взаимосвязи с показателями продуктивности (удой, содержание жира и белка) животных и жирокислотным составом молока. Исследования проводились на коровах голштинизированной черно-пестрой породы опытного хозяйства (n=310). Аллельный полиморфизм генов SCD1 и AGPAT6 оценивался с применением полимеразной цепной реакции в реальном времени. Частоты аллелей Т и С гена SCD1 rs41255693, составили 0,17 и 0,83, соответственно, а частоты аллелей G и Т гена AGPAT6 rs 211250281 составили 0,54 и 0,46 соответственно. Достоверные различия по уровню суточного удоя от генотипов получены не были. Аллель С гена SCD1 и аллель G гена AGPAT6, оказывали положительное влияние (Р≤0.001) содержание жира в молоке. По содержанию жирных кислот, животные с генотипами СТ и СС гена SCD1 превосходили животных с генотипом ТТ (Р≤0.001), за исключением транс-изомеров жирных кислот, где наблюдалась обратная ситуация. В случае с геном AGPAT6 преобладание жирных кислот наблюдалось у генотипов GG и GT, кроме транс-изомеров, где минимальные значения были у генотипа GT.
1. Введение
Молочный жир является сложносоставным продуктом состоящим из фосфолипидов, холестерина, ди- и триацилглицеридов. Триацилглицериды (TAG) составляющие основную массу жира и являясь производным глицерина и трех жирных кислот, синтезируется в молочной железе либо de novo, либо поступают из плазмы крови . Функции и характеристики TAG зависят от доступности жирных кислот присутствующих в эпителиальных тканях молочной железы. В молочном жире насчитывается свыше 400 жирных кислот, но только 15-20 из них представлены в количествах превышающие 1% от общего содержания липидов и варьируют от С4 до С18, а также включают насыщенные, моно-и полиненасыщенные жирные кислоты . Так жирные кислоты с короткой и средней цепью от С4 до С16 синтезируются de novo в молочной железе, тогда как остальные ЖК поступают из плазмы крови , липидный состав в определенной степени передается по наследству. Наследуемость содержания жирных кислот в молоке колеблется в диапазоне от 0,2 до 0,4 для насыщенных ЖК, а для таких кислот как C6:0, C8:0, C10:0 и C14:0 даже превышает указанные значения . У крупного рогатого скота генетическими исследованиями с применением GWAS-анализа, выявлены многочисленные области генома отвечающие за ассоциации с количественными признаками (QTL), но для состава и содержания жирных кислот в молоке, обнаружены только единичные гены. Значимые ассоциации в ранних исследованиях были получены для областей QTL располагающиеся на 26 и 27 хромасомах , что соответствуют генам SCD1 (Стерол-CoA десатураза 1), и AGPAT6 (1-ацилглицерин-3-фосфат-O-ацилтрансфераза). Для гена SCD1 в ряде исследований была установлена взаимосвязь с содержанием средне- и длиноцепочечных ненасыщенных жирных кислот, в частности с С14:0, С14:1 и С16:0, С16:1 у голштинов и симменталов разводимых в Италии , а также определены шесть однонуклеотидных замен, располагающиеся как и в кодирующих областях, так и в интронных, из которых была отмечена SNP c.878C>T в 3-м экзоне, приводящая к замене аланина на валин в белковой цепи . Для AGPAT6 была показана регуляторная функция в процессе синтеза липидов, т.к. он входит в семейство ферментов ацилглицерофосфатацилтрансферазы (AGPAT), при этом являясь наиболее экспрессируемым из всех генов входящих в QTL на 27 хромосоме . Нокаут AGPAT6 приводит к значительному снижению концентраций TGA в эпителиальных клетках молочной железы у коров и буйволов, а также снижению уровня экспрессии мРНК генов SCD1, DGAT1, PLIN2, что приводило к снижению количества жира и размеру липидных капель в молоке . На основании вышеизложенного целью нашей работы является оценка уровня полиморфизма генов SCD1 и AGPAT6 в популяции крупного рогатого скота голштинизированной черно-пестрой породы и влияние их на продуктивные показатели и жирнокислотный состав молока.
2. Методы и принципы исследования
Исследования проводились на животных голштинизированной черно-пестрой породы (n=310) (опытное хозяйство ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им.Л.К.Эрнста, Краснодарский край). Геномная ДНК выделялась с использованием набора «ДНК-Экстран-2» производства НПО «СИНТОЛ» из выщипов ушных раковин.
Реакцию амплификации проводили в 20 мкл смеси ПЦР, содержащей 5 мкл реактива qPCRmix-HS («Евроген», Россия), по 1 мкМ прямого и обратного праймеров, по 0,5 мкМ аллель-специфичных ДНК-зондов (Таблица 1) и10 нг ДНК.
Таблица 1 - Последовательности используемых олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зондов
AGPAT6 rs 211250281 | |
AGPAT6-F: 5′-CCAGAAAGGCTGGAGGAGTT-3′ AGPAT6-R: 5′-ATTCCCAGAAGCACAGTTTAGT T-3′ AGPAT6_G: 5′-FAM-CAAGAAAATGTGACGGTA-BHQ1-3′ AGPAT6_T:5′-HEX-CAAGAAAATTTGACGGTAT-BHQ1-3′ | |
SCD1 rs41255693 | |
SCD1-F: 5'- CCCTTATGACAAGACCATCAACC -3' SCD1-R: 5'-GACGTGGTCTTGCTGTGGACT -3' SCD1-T:5'-FAM- CTTACCCACAGCTCCCA-BHQ1-3' SCD1-С: 5'HEX-TACCCGCAGCTCCC-3- BHQ1 |
ПЦР в «реальном времени» проводим с помощью прибора Bio-Rad CFX96 в оптимизированных условиях (95 °C - 10 мин.; 95 °C - 20 сек., 55 °C - 30 сек., 72 °C 20 сек., 40 циклов). Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и HEX. Аллельная дискриминация оценивалась посредством программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager.
В исследовании учитывались следующие показатели: суточный удой (кг), массовая доля жира/белка в молоке (%), содержание казеинов (%), жирнокислотный состав молока (г/100г): С14, С16, С18, С18.1, LCFA, MCFA, MUFA, PUFA, SFA, SCFA, TFA. Данные о фракционном составе молока получали посредством индивидуального отбора проб молока во время проведения ежемесячных контрольных доений – 3 раза в сутки (утро-день-вечер) и последующего анализа в лаборатории селекционного контроля качества молока ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста на автоматическом анализаторе CombiFoss 7 DC («Foss», Дания) в период с июня 2020 по июль 2022 гг. В исследовательскую базу вошли 10243 наблюдения за период проведения исследования.
Описательные статистические параметры (среднее арифметическое, ошибка, стандартное отклонение) вычислялись при помощи пакета «Анализ данных» в среде MSExcel 2013.
3. Основные результаты
Применение метода ПЦР в режиме реального времени позволило значительно ускорить процесс постановки анализа и упростить интерпретацию результатов реакции. Амплификация каждого аллеля чётко отображалась в соответствующем канале детекции. Для каждого животного были идентифицированы все генотипы обоих исследуемых генов SCD1 и AGPAT6 (Таблица 2).
Таблица 2 - Частоты аллелей и генотипов генов SCD1 и AGPAT6 у голштинизированного черно-пестрого скота опытного хозяйства
| Частоты генотипов | Частоты аллелей | χ2 | p-value | |||
SCD1 | TT | TC | CC | T | C | 5,08 | 0,08 |
0,05 | 0,24 | 0,71 | 0,17 | 0,83 | |||
AGPAT6 | GG | GT | TT | G | T | 0,3 | 0,86 |
0,28 | 0,51 | 0,21 | 0,54 | 0,46 | |||
В рамках исследуемой выборки голштинизированных черно-пестрых коров выявлена очень низкая частота встречаемости аллеля Т (0,17) и соответственно крайне низкая частота встречаемости генотипа ТТ (0,05) SNP rs41255693 гена SCD1, с частотой гетерозигот (Ho) 0,24. Частоты встречаемости аллелей G и Т SNP rs211250281 гена AGPAT6 распределялись равномерно по выборке и составили 0,54 и 0,46, соответственно, с частотой гетерозигот (Ho) 0,51. Отклонений фактического распределения частот генотипов от теоретического согласно закону Харди-Вайнберга не наблюдалось.
Особенность низкой частоты встречаемости аллеля Т SNP rs41255693 гена SCD1, рядом авторов объясняется породоспецифичностью, что соответствует ряду исследований которые показали, аналогичные результаты у голштинской породы. Так для датских голштинов разводимых в Нидерландах в 2008 г. частоты встречаемости аллеля Т и генотипа ТТ составили 0,07 и 0,27, соответственно, с частотой гетерозигот (Ho) 0,4 , в 2012 году для голштинов разводимых в Китае, продемонстрированы аналогичные результаты с частотами аллелей С (0,789) и Т (0,211) , тот же результат был получен в 2020 на польских голштинах . При этом в более ранних исследованиях на польских голштинах, а также на датских были получены полностью противоположные результаты и аллель С имел низкую частоту встречаемости – 0,32 и 0,27 . Хотя преобладание аллеля Т у европейского скота скорее исключение, т.к. согласно многочисленным зарубежным исследованиям на разнообразных породах было показано превалирование аллеля С над Т. Так для голштинов разводимых в Европе , , , Азии и Южной Америке частоты встречаемости аллеля С варьировались в диапазоне от 0,57 до 0,65. Аналогичные результаты были получены и отечественными исследователями на первотелках голштинской породы – СС (0,384), СТ (0,457), ТТ (0,159) . Высокая частота встречаемости аллеля С SNP rs41255693 гена SCD1 также показана и у других молочных пород: айширская (0,858) , итальянская бурая (0,82) , джерсейская (0,81), чилийская Фрисон Негро (0,89) и оверо колорадо (0,92) . Умеренные частоты встречаемости были показаны для мясных пород скота и варьировали в диапазоне от 0,77 у герефордов до 0,52 у коррейского мясного скота Hanwoo , , , . Обратная ситуация характерна для аборигенных пород скота, что продемонстрировано в исследованиях на индонезийском аборигенном скоте, где частота аллеля Т составила 0,75 , а для африканских пород Borgou и White Fulani – 0,84 и 0,94 , соответственно. При этом в исследованиях на бразильском зебувидном скоте породы Гир, аллельный полиморфизм выявлен не был и все животные были представлены генотипом СС .
В промоторной области гена AGPAT6 выявлено несколько SNP: rs211250281, rs378026790, rs211036538, rs209855549 , но на текущий момент данных о полиморфизме данных SNP очень мало. Полученные нами частоты у голштинизированного черно-пестрого скота полностью соответствовали ранее проведенным исследованиям, а данные по другим породам показывают, что частоты колебались в диапозоне от 0,125/0,875 (айширская) до 0,463/0,537 (абердин-ангусская) для аллеля Т и G, соответственно .
Данные о показателях молочной продуктивности и жирнокислотном составе молока представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Среднее, минимальное и максимальное значение, коэфициент вариации показателей продуктивности и жирнокислотного состава молока
Показатель | Средняя | Мин. | Макс. | CV, % |
Суточный удой | 23±0,07 | 1 | 48 | 31,11 |
МДЖ% | 3,96±0,01 | 0,59 | 12,05 | 27,63 |
МДБ% | 3,51±0,005 | 2,19 | 6,14 | 13,01 |
Казеин | 2,8±0,004 | 1,43 | 5,05 | 14,64 |
Миристиновая (С14:0) | 0,4±0,001 | 0,12 | 1,17 | 28,41 |
Пальмитиновая (С16:0) | 0,95±0,002 | 0,23 | 3,16 | 29,02 |
Стеариновая (С18:0) | 0,33±0,001 | 0 | 1,21 | 35,07 |
Олеиновая (С18:1) | 1,15±0,003 | 0,13 | 5,07 | 29,26 |
Длинноцепочечные (LCFA) | 1,43±0,005 | 0 | 6,18 | 31,92 |
Среднецепочечные (MCFA) | 1,5±0,004 | 0,33 | 4,82 | 28,97 |
Мононенасыщенные (MUFA) | 1,11±0,003 | 0,23 | 5,01 | 28,91 |
Полиненасыщенные (PUFA) | 0,13±0,0003 | 0 | 0,35 | 24,97 |
Насыщенные (SFA) | 2,53±0,007 | 0,38 | 7,4 | 29,22 |
Короткоцепочечные (SCFA) | 0,51±0,002 | 0,02 | 1,5 | 31,94 |
Трансизомеры (TFA) | 0,09±0,0004 | 0 | 0,39 | 44,85 |
В жирнокислотном составе молока наибольшее распространение среди индивидуальных жирных кислот имела олеиновая кислота (С18:1), а среди групп – насыщенные жирные кислоты (SFA). Наибольшая изменчивость наблюдалась у трансизомеров жирных кислот (TFA) – 44,85%. Влияние аллельного полиморфизма изучаемых генов на молочную продуктивность и жирнокислотный составмлока представлено в таблице 4.
Таблица 4 - Показатели молочной продуктивности и жирнокислотного состава молока в зависимости от аллельного полиморфизма SNP rs41255693 гена SCD1 и SNP rs211250281 гена AGPAT6
Показатель | SCD1 | AGPAT6 | ||||
CC | TC | TT | TT | GT | GG | |
Суточный удой | 23,28 ±0,09 | 23,54 ±0,14 | 23,35 ±0,39 | 23,78 ±0,15 | 23,05 ±0,10 | 23,66 ±0,14 |
МДЖ% | 3,96 ±0,01 | 4,04 ±0,02 | 3,57 ±0,04 | 3,86 ±0,03 | 3,95 ±0,02 | 4,07 ±0,02 |
МДБ% | 3,52 ±0,005 | 3,51 ±0,009 | 3,48 ±0,02 | 3,51 ±0,01 | 3,50 ±0,01 | 3,53 ±0,01 |
Казеин | 2,82 ±0,005 | 2,82 ±0,01 | 2,77 ±0,02 | 2,81 ±0,01 | 2,81 ±0,01 | 2,83 ±0,01 |
Миристиновая (С14:0) | 0,39 ±0,001 | 0,41 ±0,002 | 0,35 ±0,004 | 0,39 ±0,002 | 0,39 ±0,002 | 0,40 ±0,002 |
Пальмитиновая (С16:0) | 0,95 ±0,003 | 0,97 ±0,005 | 0,82 ±0,01 | 0,91 ±0,006 | 0,95 ±0,004 | 0,98 ±0,005 |
Стеариновая (С18:0) | 0,33 ±0,001 | 0,33 ±0,002 | 0,30 ±0,005 | 0,31 ±0,002 | 0,32 ±0,002 | 0,34 ±0,002 |
Олеиновая (С18:1) | 1,15 ±0,004 | 1,16 ±0,01 | 1,10 ±0,01 | 1,14 ±0,01 | 1,15 ±0,005 | 1,17 ±0,01 |
Длинноцепочечные (LCFA) | 1,43 ±0,005 | 1,44 ±0,01 | 1,33 ±0,02 | 1,40 ±0,01 | 1,42 ±0,01 | 1,46 ±0,01 |
Среднецепочечные (MCFA) | 1,5 ±0,01 | 1,53 ±0,01 | 1,3 ±0,02 | 1,45 ±0,01 | 1,49 ±0,02 | 1,54 ±0,02 |
Мононенасыщенные (MUFA) | 1,11 ±0,004 | 1,12 ±0,01 | 1,06 ±0,01 | 1,09 ±0,01 | 1,11 ±0,005 | 1,13 ±0,01 |
Полиненасыщенные (PUFA) | 0,126 ±0,0003 | 0,128 ±0,0006 | 0,127 ±0,001 | 0,127 ±0,001 | 0,126 ±0,0004 | 0,128 ±0,001 |
Насыщенные (SFA) | 2,53 ±0,01 | 2,59 ±0,01 | 2,23 ±0,03 | 2,45 ±0,02 | 2,52 ±0,01 | 2,62 ±0,01 |
Короткоцепочечные (SCFA) | 0,50 ±0,002 | 0,52 ±0,003 | 0,45 ±0,01 | 0,49 ±0,003 | 0,50 ±0,002 | 0,52 ±0,003 |
Транс-изомеры (TFA) | 0,090 ±0,0005 | 0,092 ±0,001 | 0,097 ±0,002 | 0,093 ±0,001 | 0,09 ±0,001 | 0,093 ±0,001 |
Для SNP rs41255693 гена SCD1 имеются ряд исследований, оценивающий влияние аллельного полиморфизма на содержание жира и жирных кислот в молоке молочных пород. Так было показано, что животные с генотипом СС превосходят по содержанию жира и белка ТТ животных, с наибольшими показателями племенной ценности у гетерозигот СТ , . В нашем исследовании были получены схожие результаты по содержанию жира (P≤0,001) и белка (Р≤0.001), но достоверных различий по массовой доле белка между генотипами СС и СТ обнаружено не было.
По индивидуальным жирным кислотам рядом исследований была показана ассоциация с повышенным содержанием миристиновой (С14:0), пальмитиновой (С16:0) кислот, а для групп жирных кислот для насыщенных (SFA) и полиненасыщенных (PUFA) кислот, для генотипа ТТ, в тоже время генотип СС превосходил по содержанию мононенасыщенных (MUFA) кислот и стеариновой (С18:0) кислоты , . Нами были получены отличающиеся результаты, по всем индивидуальным и группам жирных кислот, животные с генотипом СТ и СС превосходили (P≤0.001) животных с генотипом ТТ, за исключением PUFA, где перевес был в сторону аллеля Т: +0,001 для генотипа ТТ и +0,002 (P≤0.01) для генотипа СТ, и транс-изомеров (TFA) жирных кислот, где преобладал генотип ТТ (Р≤0.05). Максимальные показатели по содержанию жирных кислот были получены для гетерозиготного генотипа СТ, что может говорить о промежуточной наследственности гена SCD1.
Несмотря на то, что открытие и исследования функций белка 1-ацилглицерол-3-фосфат О-ацилтрансфераза (AGPAT6) ведутся с 2006 года , данные об установления ассоциаций нового гена с продуктивными качествами крупного рогатого скота стали появляться только последние 5-6 лет с применением GWAS-анализа. Хотя и установлено, что данный ген играет значимую роль в регуляции синтеза триацилглицеридов и жирных кислот , данных о влияние полиморфизмов определенных SNP на продуктивность и содержание жирных кислот отсутствуют. Полученные нами результаты свидетельствуют о положительном влиянии аллеля G (P≤0.001) SNP rs211250281 гена AGPAT6 на содержание жира в зависимости от количества аллелей в генотипе. Исследованиями E.Viale (2017) , была показано влияние AGPAT6 на технологические свойства молока, а именно время свертывания под воздействием сычужного фермента, но в нашем исследовании достоверной ассоциации с содержанием белка и казеина обнаружено не было.
Влияние на содержание индивидуальных и групп жирных кислот, показало достоверную ассоциацию с аллелью G для миристиновой (С14:0) (P≤0.01), пальмитиновой (С16:0), среднецепочечных (MCFA), насыщенных (SFA) и короткоцепочечных (SCFA) (P≤0.001) жирных кислот. Стеариновой (С18:0) жирной кислоты было показано преобладание генотипа GT над TT (P≤0.05), но достоверных различий у олеиновой (С18:1) кислоты, а также длинноцепочечных (LCFA), мононенасыщенных (MUFA) кислот обнаружено не было, при этом образцы от животных с генотипом GG превосходили (P≤0.05) остальные генотипы по содержанию данных кислот.
Аналогично с геном SCD1 для полиненасыщенных (PUFA) и транс-изомеров (TFA) жирных кислот, были получены отличимые результаты, так минимальное содержание данных кислот было характерно для генотипа GT (P≤0.001), с отсутствием достоверных отличий у гомозиготных генотипов. Стоит отметить, что TFA получаются путем биогидрогенизации в рубце коровы из PUFA, но в исследуемой выборке данные кислоты были представлены в наименьшем количестве (табл.3). Указанное дает возможность предположить, что данные кислоты больше подвержены влиянию средовых факторов, таких как тип кормления, содержание животных, а не аллельному полиморфизму.
4. Заключение
В нашем исследовании был изучен аллельный полиморфизм генов SCD1 и AGPAT6 и оценено влияние на молочную продуктивность и жирнокислотный состав молока голштинизированных черно-пестрых коров. Частота встречаемости аллелей С и Т для SNP rs41255693 гена SCD1 составили 0,83 и 0,17, соответственно, а для аллелей G и Т SNP rs211250281 гена AGPAT6 – 0,54 и 0,46. Достоверные различия по уровню суточного удоя от генотипов получены не были. На содержание жира и жирных кислот в молоке большее влияние оказывали аллели С гена SCD1 и G гена AGPAT6. Для проведения селекционной работы желательно отбирать животных с генотипами СТ и СС гена SCD1 и гена AGPAT6 генотипы GG и GT. Использование данных о полиморфизмах изученных генов в селекционных программах и при подборах родительских пар способствует улучшению показателей продуктивности животных, а в частности повышению содержания жира в молоке. Однако для того чтобы предложенные гены могли бы использоваться как генетические маркеры хозяйственно-полезных признаков, необходимо более развёрнутое исследование на разводимых в нашей стране пород скота, особенно на отечественных генофондных породах.