Синтез сферического ватерита при кристаллизации карбоната кальция в присутствии альбумина

Актуальность и постановка задачи

В современном мире карбонат кальция находит применение в различных отраслях, но наибольший интерес представляет использование его в медицине

Стабильное получение сферических частиц карбоната кальция микронного и субмикронного размера достаточно затруднительно, поскольку результат синтеза зависит от ряда параметров. Таких как концентрация солей, концентрация примесей, соотношение растворов, время синтеза и т. д. В литературе описаны различные методики синтеза, в результате которых наблюдается формирование сферического ватерита определенного размера и формы. На сегодняшний день, возможно получать частицы ватерита в пределах от 430 нм

В настоящее время получение CaCO3 осуществляется двумя основными химическими методами: твердофазным и методом химического осаждения

Целью настоящей работы являлось отработка условий получения сферических частиц карбоната кальция (ватерита) в присутствии бычьего сывороточного альбумина методом химического осаждения.

Выбор в качестве добавки альбумина обусловлен тем, что белки, содержащие большое количество функциональных групп, оказывают влияние на процесс биоминерализации, поскольку на стадии зародышеобразования CaCO3 является чувствительным к присутствию органических добавок. Молекулы бычьего сывороточного альбумина (БСА) оказывают влияние на кристаллизацию карбоната кальция, поскольку в третичной структуре белка положительно и отрицательно заряженные функциональные группы расположены близко друг к другу. Исходя из этого, они могут связывать ионы из маточного раствора, образуя области, пересыщенные Ca2+ и CO32-. Так как ватерит является метастабильной модификацией карбоната кальция, то центрами кристаллизации будут являться молекулы белка

Частицы карбоната кальция были получены согласно химической реакции СаСl2+Na2CO3=СаCO3+2NaCl. Водный раствор бычьего сывороточного альбумина в концентрациях 3,5-5,5 г/л добавляли в полученный раствор солей CaCl2 и Na2CO3, которые предварительно были смешаны магнитной мешалкой в течение 2 мин. Отбор проб проводился через каждые 10 минут. После подбора концентрации при которой наблюдалась преимущественная кристаллизация ватерита, отбор проб при этой концентрации (4,25 г/л) проводился через 30 с, 1 мин, 10 мин и 30 мин после добавления раствора БСА. Морфологию и размеры полученных порошков исследовали с помощью растровой электронной (JSM-6610LV) и оптической микроскопии (Neophot-2). Фазовый анализ проводили по дифрактограммам, снятым на рентгеновском дифрактометре «ДРОН-3М» с использованием излучения CuКα.

Для получения преимущественно частиц сферического ватерита была проведена серия синтезов при варьировании концентрации альбумина и времени смешивания растворов. Исследования показали, что при наименьшей в данном эксперименте концентрации альбумина 3,5 г/л наблюдалось формирование частиц кальцита со средним размером ~1,6 мкм. Присутствие данной фазы карбоната кальция подтверждается данными оптической и электронной микроскопии, а также рентгенофазового анализа. Обнаружены частицы характерной для кальцита таблетчатой формы (рис. 1А). При этом увеличение времени кристаллизации приводит к образованию конгломератов из частиц кальцита.    

Рисунок 1 - Кристаллы карбоната кальция, полученные при концентрации альбумина 3,5 г/л:

а – морфология частиц кальцита; б – дифрактограмма порошка карбоната кальция

DOI:10.60797/IRJ.2025.160s.37.1

На дифрактограмме присутствуют рефлексы фазы кальцита и арагонита, при этом преобладающей фазой при данной концентрации бычьего сывороточного альбумина является кальцит (рис. 1Б).

Повышение концентрации бычьего сывороточного альбумина до 4,25 г/л привело к формированию частиц преимущественно шарообразной формы — ватерита. Помимо ватерита, обнаруживаются частицы кубической формы — кальцит (рис. 2).

Рисунок 2 - Кристаллы карбоната кальция, полученные при концентрации альбумина 4,25 г/л:

а – морфология частиц сферического ватерита и кубического кальцита; б – соответствующая для этой концентрации дифрактограмма порошка карбоната кальция

DOI:10.60797/IRJ.2025.160s.37.2

Размеры синтезированных частиц сферического ватерита составили ~1-3 мкм.

Данные рентгенофазового анализа показали присутствие фаз ватерита, кальцита и арагонита. Интенсивность фазы кальцита уменьшилась практически в 3 раза по сравнению с предыдущими результатами (рис. 2Б). Также прослеживается уменьшение интенсивности фазы арагонита.

При увеличении концентрации бычьего сывороточного альбумина до 4,5 г/л наблюдался рост размеров сферических частиц ватерита, которые изменялись в пределах от 5,5 мкм до 55,1 мкм. На фоне небольшого количества мелких частиц овальной, продолговатой и квадратной форм обнаруживались отдельные крупные кристаллы ватерита (рис. 3).

Рисунок 3 - Кристаллы карбоната кальция, полученные при концентрации альбумина 4,5 г/л

DOI:10.60797/IRJ.2025.160s.37.3

В результате кристаллизации карбоната кальция в наибольших концентрациях БСА в данном эксперименте (5 г/л и 5,5 г/л) сформировались крупные (~55 мкм) разрозненные частицы ватерита, количество которых резко уменьшилось.     

Рисунок 4 - Кристаллы карбоната кальция, полученные при концентрации альбумина 5 (а) и 5,5 г/л (б)

DOI:10.60797/IRJ.2025.160s.37.4

В результате проведенных экспериментов было установлено, что кристаллизация сферического ватерита микронного размера (~1–3 мкм) наблюдалась при концентрации альбумина 4,25 г/л.

С целью отработки методики синтеза сферического ватерита микронного размера проведены эксперименты по его получению при подобранной концентрации альбумина 4,25 г/л при варьировании времени смешивания маточного раствора и раствора альбумина. Исследование пробы, в которой альбумин был добавлен в маточный раствор сразу после смешивания растворов солей показало, что синтезируется порошок со сросшимися частицами карбоната кальция (рис. 5).

Рисунок 5 - Частицы карбоната кальция, полученные при концентрации альбумина 4,25 г/л без выдерживания времени смешивания растворов:

а – морфология частиц; б – соответствующая дифрактограмма порошка карбоната кальция

DOI:10.60797/IRJ.2025.160s.37.5

По данным РФА полученная смесь состоит фаз ватерита, арагонита и кальцита (рис. 5). Интенсивность фазы ватерита уменьшилась практически в 2 раза по сравнению с синтезом при такой же концентрации альбумина, описанным выше. Интенсивность фазы арагонита увеличилась. При этом содержание фазы кальцита уменьшилось. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости выдерживания определенного времени для перемешивания растворов солей перед добавлением альбумина.

Опытным путем подобрано время смешивания растворов солей. По данным оптической микроскопии обнаружено, что при смешивании маточного раствора в течение 10 с кристаллизуются сферические кристаллы со средним размером ~19 мкм. Увеличение времени смешивания растворов CaCl2 и Na2CO3 до 20 с привело к уменьшению размеров частиц ватерита в 6 раз (~3 мкм). Далее при 30 с перемешивания сформировались кристаллы ~7 мкм.

Затем было проведено 4 синтеза по той же методике, однако водный раствор БСА в концентрации 4,25 г/л добавлялся после 20 с смешивания растворов солей. Пробы отбирались через 30 с, 1 мин, 10 мин, 30 минут после добавления в маточный раствор водного раствора бычьего сывороточного альбумина. Смешивание в течение 30 с привело к образованию сферических частиц ватерита с размерами ~1,5-2 мкм (рис. 6). При этом помимо сферических частиц ватерита наблюдались также частицы кубической формы. Следует отметить увеличение пористости полученных сферических кристаллов.    

Рисунок 6 - Частицы карбоната кальция, полученные при концентрации альбумина 4,25 г/л при смешивании растворов в течение 30 с: 

а – морфология частиц сферического ватерита; б – соответствующая дифрактограмма порошка карбоната кальция при этих условиях кристаллизации

DOI:10.60797/IRJ.2025.160s.37.6

Анализ рентгеновского спектра данного образца показал присутствие всех трех фаз, что подтверждает данные электронной микроскопии. При этом, по данным РФА наибольшей интенсивностью обладает фаза ватерита, что свидетельствует о ее большем процентном содержании.

Кристаллизация в течение 1 и 10 мин привела к формированию частиц пористого сферического ватерита с небольшим содержанием кальцита и арагонита. Размеры частиц ватерита ~1,5 мкм и ~1-1,5 мкм, соответственно (рис. 7).

Рисунок 7 - Частицы карбоната кальция, полученные при концентрации альбумина 4,25 г/л при смешивании растворов в течение 1 мин (а) и 10 мин (б)

DOI:10.60797/IRJ.2025.160s.37.7

Анализ дифрактограмм показал, что при смешивании раствора солей и БСА в течение 1 мин наблюдается уменьшение содержания фаз ватерита и кальцита и небольшой рост интенсивности фазы арагонита по сравнению с дифрактограммой образца с 30с временем смешивания растворов (рис. 8А).

Рисунок 8 - Дифрактограммы карбоната кальция, синтезированного при 4,25 г/л альбумина:

а – при смешивании в течение 1 мин; б – при смешивании в течение 10 мин

DOI:10.60797/IRJ.2025.160s.37.8

Исходя из данных РФА, при смешивании растворов течение 10 минут наблюдается небольшое увеличение интенсивности фаз ватерита и кальцита и уменьшение интенсивности фазы арагонита (рис. 8Б). Для двух образцов, при смешивании в течение 1 мин и 10 мин, преобладающей фазой карбоната кальцита является ватерит. Прослеживается только незначительное изменение интенсивности фазы арагонита. Из анализа морфологии частиц ватерита и их количества установлено, что оптимальным временем смешивания растворов является 1 минута. При этом режиме кристаллизации образуются отдельные сферические пористые частицы ватерита, количество которых превышает аналогичные при других режимах синтеза.  

В результате кристаллизации в течение 30 минут наблюдаются частицы карбоната кальция - кубический кальцит, сферический ватерит со средним размером ~1,5–2 мкм (рис. 9А). При этом обнаружен рост интенсивности фазы арагонита в ~1,3 раза по сравнению с интенсивностью дифракционных рефлексов порошка, полученного через 30 сек после смешивания альбумина с раствором солей (рис. 9 Б).

Рисунок 9 - Частицы карбоната кальция, полученные при концентрации альбумина 4,25 г/л при смешивании растворов в течение 30 мин:

а – морфология частиц; б – соответствующая этим условиям кристаллизации дифрактограмма порошка карбоната кальция

DOI:10.60797/IRJ.2025.160s.37.9

Анализ дифрактограммы показал, что, как и во всех предыдущих четырех синтезах, преобладает фаза ватерита. Тем не менее прослеживается рост содержания фаз кальцита и арагонита при возрастании времени кристаллизации.

Синтез карбоната кальция в присутствии бычьего сывороточного альбумина приводит к формированию фаз сферического ватерита, кубического кальцита и арагонита. Наблюдается зависимость концентрации и размеров частиц сферического ватерита от концентрации альбумина и времени его смешивания с раствором солей. При концентрации альбумина 4,25 г/л обнаружена преобладающая кристаллизация гладкого сферического ватерита с размерами ~123 мкм. Синтез с большей концентрацией приводит к росту размеров ватерита до 55 мкм. Увеличение времени смешивания альбумина с раствором солей при найденной фиксированной концентрации 4,25 г/л позволило получить пористые сферические частицы ватерита с размерами 1–1,5 мкм. Установлено, что 1 минута смешивания растворов является оптимальным временем для кристаллизации пористого сферического ватерита, который будет использован для капсулирования биологически-активных веществ. Одновременная кристаллизация с ватеритом кальцита и арагонита говорит о недостаточной эффективности молекул белка на процесс кристаллизации ватерита.