1. Введение

Актуальность и постановка задачи

В современном мире карбонат кальция находит применение в различных отраслях, но наибольший интерес представляет использование его в медицине [1], [2], [3]. В частности, в регенеративной и тканевой медицине в качестве костного цемента и замещающего композитного материала зубных имплантатов и протезов [2], [3], [4]. Карбонат кальция (CaCO3) существует в трех полиморфных модификациях: кальцит (кубические кристаллы с ромбоэдрической кристаллической решеткой), ватерит (сферические кристаллы с гексагональной решеткой), арагонит (игольчатые кристаллы с орторомбической кристаллической решеткой). Также могут встречаться слоистые [5], [6], шестиугольные [6], розеткообразные [7], [8], линзообразные [7], [9] кристаллы, в том числе и их комбинации [10]. Следует отметить, что одна из модификаций карбоната кальция — ватерит — может использоваться в качестве контейнеров для биологически активных молекул благодаря пористости, большой удельной поверхности, низкой токсичности и высокой растворимости. Это позволит переносить различные лекарственные препараты с возможностью контролируемого высвобождения [2].

Стабильное получение сферических частиц карбоната кальция микронного и субмикронного размера достаточно затруднительно, поскольку результат синтеза зависит от ряда параметров. Таких как концентрация солей, концентрация примесей, соотношение растворов, время синтеза и т. д. В литературе описаны различные методики синтеза, в результате которых наблюдается формирование сферического ватерита определенного размера и формы. На сегодняшний день, возможно получать частицы ватерита в пределах от 430 нм [11] до 5 мкм [12]. При варьировании соотношения солей в результате синтеза карбоната кальция могут кристаллизоваться частицы овальной и звездчатой формы соответствующих размеров [13]. Несмотря на большое количество различных методик синтеза, кристаллизация исключительно сферического ватерита определенного размера является большой проблемой. В представленных в литературе экспериментах наряду с ватеритом обнаруживаются и другие модификации карбоната кальция (кальцит и арагонит) в разном соотношении. При этом содержание фазы ватерита и размеры частиц варьируются даже при идентичных условиях кристаллизации. Поэтому подбор концентраций и условий кристаллизации с различными добавками для получения преимущественно сферического ватерита является актуальной задачей.

В настоящее время получение CaCO3 осуществляется двумя основными химическими методами: твердофазным и методом химического осаждения [14]. Применение твердофазного синтеза крайне ограничено, поскольку, формируются полидисперсные (отличающиеся по размеру) кристаллы неправильной формы. Метод химического осаждения имеет различные модификации для получения карбоната кальция из реакционного раствора, содержащего ионы кальция (Ca2+) и карбонат ионы (CO32-), которые, в свою очередь, позволяют регулировать физико-химические характеристики синтеза, что приводит к варьированию размера и качества получаемых частиц.

Целью настоящей работы являлось отработка условий получения сферических частиц карбоната кальция (ватерита) в присутствии бычьего сывороточного альбумина методом химического осаждения.

Выбор в качестве добавки альбумина обусловлен тем, что белки, содержащие большое количество функциональных групп, оказывают влияние на процесс биоминерализации, поскольку на стадии зародышеобразования CaCO3 является чувствительным к присутствию органических добавок. Молекулы бычьего сывороточного альбумина (БСА) оказывают влияние на кристаллизацию карбоната кальция, поскольку в третичной структуре белка положительно и отрицательно заряженные функциональные группы расположены близко друг к другу. Исходя из этого, они могут связывать ионы из маточного раствора, образуя области, пересыщенные Ca2+ и CO32-. Так как ватерит является метастабильной модификацией карбоната кальция, то центрами кристаллизации будут являться молекулы белка [17], [18]. Область вокруг молекул БСА будет более пересыщена относительно всего объема раствора, что связано с образованием комплексов между карбонат-ионами и молекулами белка.

2. Методика эксперимента

Частицы карбоната кальция были получены согласно химической реакции СаСl2+Na2CO3=СаCO3+2NaCl. Водный раствор бычьего сывороточного альбумина в концентрациях 3,5-5,5 г/л добавляли в полученный раствор солей CaCl2 и Na2CO3, которые предварительно были смешаны магнитной мешалкой в течение 2 мин. Отбор проб проводился через каждые 10 минут. После подбора концентрации при которой наблюдалась преимущественная кристаллизация ватерита, отбор проб при этой концентрации (4,25 г/л) проводился через 30 с, 1 мин, 10 мин и 30 мин после добавления раствора БСА. Морфологию и размеры полученных порошков исследовали с помощью растровой электронной (JSM-6610LV) и оптической микроскопии (Neophot-2). Фазовый анализ проводили по дифрактограммам, снятым на рентгеновском дифрактометре «ДРОН-3М» с использованием излучения CuКα.

3. Результаты и их обсуждение

Для получения преимущественно частиц сферического ватерита была проведена серия синтезов при варьировании концентрации альбумина и времени смешивания растворов. Исследования показали, что при наименьшей в данном эксперименте концентрации альбумина 3,5 г/л наблюдалось формирование частиц кальцита со средним размером ~1,6 мкм. Присутствие данной фазы карбоната кальция подтверждается данными оптической и электронной микроскопии, а также рентгенофазового анализа. Обнаружены частицы характерной для кальцита таблетчатой формы (рис. 1А). При этом увеличение времени кристаллизации приводит к образованию конгломератов из частиц кальцита.    

На дифрактограмме присутствуют рефлексы фазы кальцита и арагонита, при этом преобладающей фазой при данной концентрации бычьего сывороточного альбумина является кальцит (рис. 1Б).

Повышение концентрации бычьего сывороточного альбумина до 4,25 г/л привело к формированию частиц преимущественно шарообразной формы — ватерита. Помимо ватерита, обнаруживаются частицы кубической формы — кальцит (рис. 2).

Размеры синтезированных частиц сферического ватерита составили ~1-3 мкм.

Данные рентгенофазового анализа показали присутствие фаз ватерита, кальцита и арагонита. Интенсивность фазы кальцита уменьшилась практически в 3 раза по сравнению с предыдущими результатами (рис. 2Б). Также прослеживается уменьшение интенсивности фазы арагонита.

При увеличении концентрации бычьего сывороточного альбумина до 4,5 г/л наблюдался рост размеров сферических частиц ватерита, которые изменялись в пределах от 5,5 мкм до 55,1 мкм. На фоне небольшого количества мелких частиц овальной, продолговатой и квадратной форм обнаруживались отдельные крупные кристаллы ватерита (рис. 3).

В результате кристаллизации карбоната кальция в наибольших концентрациях БСА в данном эксперименте (5 г/л и 5,5 г/л) сформировались крупные (~55 мкм) разрозненные частицы ватерита, количество которых резко уменьшилось.     

В результате проведенных экспериментов было установлено, что кристаллизация сферического ватерита микронного размера (~1–3 мкм) наблюдалась при концентрации альбумина 4,25 г/л.

С целью отработки методики синтеза сферического ватерита микронного размера проведены эксперименты по его получению при подобранной концентрации альбумина 4,25 г/л при варьировании времени смешивания маточного раствора и раствора альбумина. Исследование пробы, в которой альбумин был добавлен в маточный раствор сразу после смешивания растворов солей показало, что синтезируется порошок со сросшимися частицами карбоната кальция (рис. 5).

По данным РФА полученная смесь состоит фаз ватерита, арагонита и кальцита (рис. 5). Интенсивность фазы ватерита уменьшилась практически в 2 раза по сравнению с синтезом при такой же концентрации альбумина, описанным выше. Интенсивность фазы арагонита увеличилась. При этом содержание фазы кальцита уменьшилось. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости выдерживания определенного времени для перемешивания растворов солей перед добавлением альбумина.

Опытным путем подобрано время смешивания растворов солей. По данным оптической микроскопии обнаружено, что при смешивании маточного раствора в течение 10 с кристаллизуются сферические кристаллы со средним размером ~19 мкм. Увеличение времени смешивания растворов CaCl2 и Na2CO3 до 20 с привело к уменьшению размеров частиц ватерита в 6 раз (~3 мкм). Далее при 30 с перемешивания сформировались кристаллы ~7 мкм.

Затем было проведено 4 синтеза по той же методике, однако водный раствор БСА в концентрации 4,25 г/л добавлялся после 20 с смешивания растворов солей. Пробы отбирались через 30 с, 1 мин, 10 мин, 30 минут после добавления в маточный раствор водного раствора бычьего сывороточного альбумина. Смешивание в течение 30 с привело к образованию сферических частиц ватерита с размерами ~1,5-2 мкм (рис. 6). При этом помимо сферических частиц ватерита наблюдались также частицы кубической формы. Следует отметить увеличение пористости полученных сферических кристаллов.    

Кристаллизация в течение 1 и 10 мин привела к формированию частиц пористого сферического ватерита с небольшим содержанием кальцита и арагонита. Размеры частиц ватерита ~1,5 мкм и ~1-1,5 мкм, соответственно (рис. 7).

Анализ дифрактограмм показал, что при смешивании раствора солей и БСА в течение 1 мин наблюдается уменьшение содержания фаз ватерита и кальцита и небольшой рост интенсивности фазы арагонита по сравнению с дифрактограммой образца с 30с временем смешивания растворов (рис. 8А).

Исходя из данных РФА, при смешивании растворов течение 10 минут наблюдается небольшое увеличение интенсивности фаз ватерита и кальцита и уменьшение интенсивности фазы арагонита (рис. 8Б). Для двух образцов, при смешивании в течение 1 мин и 10 мин, преобладающей фазой карбоната кальцита является ватерит. Прослеживается только незначительное изменение интенсивности фазы арагонита. Из анализа морфологии частиц ватерита и их количества установлено, что оптимальным временем смешивания растворов является 1 минута. При этом режиме кристаллизации образуются отдельные сферические пористые частицы ватерита, количество которых превышает аналогичные при других режимах синтеза.  

В результате кристаллизации в течение 30 минут наблюдаются частицы карбоната кальция - кубический кальцит, сферический ватерит со средним размером ~1,5–2 мкм (рис. 9А). При этом обнаружен рост интенсивности фазы арагонита в ~1,3 раза по сравнению с интенсивностью дифракционных рефлексов порошка, полученного через 30 сек после смешивания альбумина с раствором солей (рис. 9 Б).

Анализ дифрактограммы показал, что, как и во всех предыдущих четырех синтезах, преобладает фаза ватерита. Тем не менее прослеживается рост содержания фаз кальцита и арагонита при возрастании времени кристаллизации.

4. Заключение

Синтез карбоната кальция в присутствии бычьего сывороточного альбумина приводит к формированию фаз сферического ватерита, кубического кальцита и арагонита. Наблюдается зависимость концентрации и размеров частиц сферического ватерита от концентрации альбумина и времени его смешивания с раствором солей. При концентрации альбумина 4,25 г/л обнаружена преобладающая кристаллизация гладкого сферического ватерита с размерами ~123 мкм. Синтез с большей концентрацией приводит к росту размеров ватерита до 55 мкм. Увеличение времени смешивания альбумина с раствором солей при найденной фиксированной концентрации 4,25 г/л позволило получить пористые сферические частицы ватерита с размерами 1–1,5 мкм. Установлено, что 1 минута смешивания растворов является оптимальным временем для кристаллизации пористого сферического ватерита, который будет использован для капсулирования биологически-активных веществ. Одновременная кристаллизация с ватеритом кальцита и арагонита говорит о недостаточной эффективности молекул белка на процесс кристаллизации ватерита.

The additional file for this article can be found as follows: