ВЛИЯНИЯ ТРИТЕРПЕНОИДА РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 3-B-МЕТОКСИ-D-18-ОЛЕАНЕНА НА ВЫРАЖЕННОСТЬ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ И ДИСЛИПОПРОТЕИНЕМИИ У КРЫС ПРИ НОРМАЛЬНОЙ ДИЕТЕ И ДИЕТЕ С УМЕРЕННЫМ ПОВЫШЕНИЕМ КАЛОРИЙНОСТИ

Влияния тритерпеноида растительного происхождения 3-b-метокси-D-18-олеанена на выраженность гиперхолестеринемии и дислипопротеинемии у крыс при нормальной диете и диете с умеренным повышением калорийности

Научная статья

Шарапова Н.В.¹, Чаловская О.В.^{2, *}, Гирина Л.В.³, Ковалева Ф.Ф.⁴

^{1, 2, 3, 4} Оренбургский государственный медицинский университет, Оренбург, Россия

* Корреспондирующий автор (chov3110[at]yandex.ru)

Аннотация

Повышение калорийности диеты за счет включения в суточный рацион животных дополнительного количества нейтрального жира до 10% пищевого рациона, в виде маргарина, оказывает умеренный обесогенный эффект. Этот эффект проявилсяизменениями в липидном спектре крови, которые характеризовались гиперхолестеринемией, с одновременным снижением уровня ЛПВП, а также более высоким уровнем триацилглицеринов. Подобные изменения характерны для дислипопротеинемий, наблюдаемых при ожирении [16, С.1526-1531], [17, С.21-27]. Применение растительного тритерпеноида милиацина само по себе не приводило к изменению показателей липидного спектра, но в сочетании с потреблением маргарина ограничивало развитие гиперхолестеринемии и дислипопротеинемии, характерные для ожирения.

Ключевые слова: милиацин, диета с умеренным повышением калорийности, гиперхолестеринемия, дислипопротеинемия.

Effects of Plant-Derived Triterpenoid 3-b-methoxy-D-18-oleanene on the Severity of Hypercholesterolemia and Dyslipoproteinemia in Rats with a Normal Diet and a Diet with a Moderate Increase in Calories

Research article

Sharapova N.V.¹, Chalovskaya O.V.^{2, *}, Girina L.V.³, Kovaleva F.F.⁴

^{1, 2, 3, 4} Orenburg State Medical University, Orenburg, Russia

* Corresponding author (chov3110[at]yandex.ru)

Abstract

Increasing the caloric content of the diet by including an additional amount of neutral fat up to 10% of the diet in the daily diet of animals (in the form of margarine) has a moderate obesogenic effect. This effect was manifested by changes in the lipid spectrum of the blood, which were characterized by hypercholesterolemia, with a simultaneous decrease in HDL levels, as well as a higher level of triacylglycerols. Similar changes are characteristic of dyslipoproteinemia that are observed in obesity [16, P.1526-1531], [17, P.21-27]. The use of the vegetable triterpenoid miliacin by itself did not lead to changes in the lipid spectrum; however, in combination with the consumption of margarine limited the development of hypercholesterolemia and dyslipoproteinemia characteristic of obesity.

Keywords: miliacin, diet with moderate increase in calories, hypercholesterolemia, dyslipoproteinemia.

Введение

Гиперхолестеринемия (ГХС) – это не отдельное самостоятельное заболевание, это важнейший фактор риска в возникновении и прогрессировании ишемической болезни сердца (ИБС), наряду с сахарным диабетом, ожирением, артериальной гипертензией [6], [15, С.21-27]. Гиперхолестеринемия считается одним из основных факторов развития атеросклероза и его осложнений. Этот риск повышается пропорционально к снижению холестерина антиатерогенных фракций липопротеинов - ЛПВП.

Растительные тритерпеноиды нашли широкое практическое применение в медицине. Не исключение и милиацин, входящий в состав просяного масла [4, С.37-59], [5,С.382-385], [6,С.633-635] и используемый для лечения различных заболеваний [3, С.50-51], [5,С.382-385]. Милиацин стимулирует факторы неспецифической защиты [2, С.70-74], [6], стимулирует иммунный ответ [11, С.1-10], обладает антиоксидантной, мембранопротекторной и антиапоптотической [1, С.12-15], [7], [10, С.3-8] активностью. Описано использование тритерпеноидного соединения 3-b,30-дигидрокси-20(29)-ен-2-она, проявляющего гипогликемическую и антидиабетическую активность в качестве средства для лечения диабета [18, С.2420-2425], [19, С.412-419], [21]. Экпериментально показано, что тритерпеноид растительного происхождения 3-b-метокси-D-18-олеанен обладает широким спектром биологической активности [17, С.21-27], [20], [21], [22, С.14-19]. Однако вопрос о способности милиацина ограничивать развитие гиперхолестеринемии и дислипопротеинемии, характерных для ожирения, не исследовался. Поэтому целью работы является изучение влияния милиацина на выраженность гиперхолестеринемии и дислипопротеинемии при нормальной пищевом рационе и диете с умеренным повышением калорийности. Данная проблема является актуальной и заслуживает детального изучения.

Методы и принципы исследования

 Эксперимент проводился на 80 крысах-самцах линии Vistar. В течение всего эксперимента в качестве основного рациона был использован сбалансированный гранулированный корм «ProCorm» компании Biopro г. Новосибирск. Начальной масса животных составляла 150±10 г. Условия содержания животных в эксперименте были одинаковые, доступ к пище и воде свободный и неограниченный. В соответствие с программой испытаний животные были разбиты на 4 группы. Первая группа служила контролем. Крысы второй группы дополнительно к стандартному рациону ежедневно получали маргарин (далее насыщенные липиды). Масса маргарина рассчитывалась исходя из увеличения суточной калорийности потребляемой животными пищи на 10%. Животные третьей группы получали тритерпеноид растительного происхождения 3-b-метокси-D18–олеанен (милиацин) в дозе 2 мг на килограмм массы животного в комплексе с 25 мкл раствора нейтральных жиров натощак. Животные четвертой группы получали сочетано маргарин и милиацин в указанной выше дозе натощак. Нейтральные жиры в эксперименте использовали для растворения гидрофобного милиацина, поэтому, для создания равных условий опыта, контрольная и второй группы также получали перорально раствор нейтральных липидов. Тритерпеноид растительного происхождения 3-b-метокси-D 18 –олеанен (милиацин) был получен по стандартной методике. Индуцирование гиперхолестиринемии и дислипопротеинемии у экспериментальных животных достигается использованием диеты с умеренным повышением калорийности за счет увеличения содержания в пищевом рационе липидов в соответствии с рекомендациями R. Buettner и Takahashi и соавт. Превышение калорийности пищи над реальными энергозатратами считается одной, но наиболее частой причиной развития широкого спектра заболеваний. Поэтому заявляемая в эксперименте методика является наиболее приближенной к клинической практике в медицине.

Общая продолжительность исследования составила 7 недель. Эксперимент был проведен в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, которые отражены в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей».

 По окончании опытов животных выводили из эксперимента под легким фторотановым наркозом путем декапитации. За 12 часов перед забоем животных лишали пищи и в клетках оставляли только воду. Кровь собирали в пробирки фирмы Sarstedt (ФРГ), содержащие активатор свертывания.Пробы крови, содержащие активатор свертывания, центрифугировали 10 мин. при 3000 об/мин. Полученную сыворотку использовали для биохимических исследований, которые выполняли на биохимической станции Cobas-6000 (Швейцария) с использованием стандартных тест систем совместимых с данным анализатором.

Микроскопическое исследование кала на нейтральный жир и жирные кислоты проводилось с использованием набора реагентов Клиника-КАЛ комплект №1 (общий) № ФСР 2010/09420 от 08.12.2010.

Влияние тритерпеноида милиацина на выраженность гиперхолестеринемии и дислипопротеинемии оценивалось на основе анализа экспериментальных масс жировой ткани, а также по содержанию в сыворотке крови экспериментальных животных концентраций триацилглицеринов (ТАГ), общего холестерина (ХС) и холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), липопротеинов очень низкой (ЛПОНП) и низкой плотности (ЛПНП). Выраженность дислипопротеинемии оценивалась по величине Индекса атерогенности (ОХ – ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП.

Результаты исследований были обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета стандартных программ для ПК “MicrosoftExcel 7.0,” “STATISTICА10.0”

Основные результаты

В таблице 1 отражены метаболические показатели у крыс контрольных и опытных животных. Масса эпидидимального жира у животных, получавших диету с умеренным повышением калорийности, на 78% выше, чем в контрольной группе.

Таблица 1 – Влияния тритерпеноида растительного происхождения 3-b-метокси-D-18-олеанена на метаболические показатели у крыс

Показатели, ед.	Группы животных, M±m (n=20)
	Интактные	ДПК	Милиацин	ДПК + милиацин	P
Масса эпидидимального жира, г	5,0± 0,7	8,9±1,2	4,97±0,3	5,09±0,5	0,01
Холестерин, ммоль/л	1,45±0,07	1,66±0,04	1,43±0,04	1,52±0,05	0,014
ХС ЛПВП, ммоль/л	1,19±0,1	0,99±0,07	1,21±0,08	1,34±0,08	0,111
ТАГ, моль/л	0,89±0,09	1,27±0,1	0,86±0,06	0,82±0,06	0,008
Индекс атерогенности	0,21±0,05	0,67±0,06	0,21±0,06	0,13±0,05	0,037
НЭЖК, моль/л	0,68±0,05	0,85±0,06	0,72±0,05	0,62±0,05	0,037

Поскольку известно, что масса эпидидимального жира отражает общее количество жировой ткани в организме [8], [9], данный результат свидетельствует о том, что увеличение калорийности диеты на 10% за счет включения в рацион жира приводило к повышению содержание жировой ткани у опытных крыс. Введение в высококалорийный рацион милиацина, не приводило к увеличению массы эпидидимального жира, его масса оставалась такой же как у животных первой группы. В то же время масса эпидидимального жира в группе животных, получавших сочетано маргарин и милиацин, была на 40% ниже, чем в группе крыс, потреблявших сбалансированный корм и маргарин. Между контрольной группой и группой, получавшей милиацин, достоверных различий не обнаружено.

Далее из таблицы видно, потребление диеты с умеренным повышением калорийности также проявлялось в увеличении уровня общего холестерина на 14%, и, напротив, в снижении антиатерогенной фракции ХС ЛПВП на 20%, в сравнении с контрольной группой. Одновременно с этим у опытных животных этой группы, содержание ТАГ было на 43% выше, чем у животных, находящихся на стандартном рационе. Эффектом потребления милиацина совместно с высококалорийной диетой являлось снижение уровня общего холестерина на фоне повышения ХС ЛПВП в сравнении с показателями группы, получавшей жир в дополнение к стандартному рациону, что составило 9% и 35% соответственно. Описанные изменения происходили на фоне снижения уровня ТАГ, понижение показателя составляло 54%. Из таблицы видно, что изменение показателей липидного обмена для контрольной и экспериментальной групп, в которой животные получали в дополнение к стандартному рациону только милиацин, существенно не различались.

Индекс атерогенности в группе крыс, получавших маргарин, был в 3 раза выше, чем в остальных группах. В группе, получавшей как жир, так и милиацин, индекс атерогенности был в 1,6 раза ниже, чем в группе животных, содержавшихся на диете с умеренным повышением калорийности.

Результаты микроскопического исследования кала животных опытных групп (см. таблицу 2) показали, что увеличение калорийности рациона на 10% способствовало снижению содержания в кале НЭЖК на 17% по сравнению с контрольной группой. В то же время, содержание ТАГ в кале крыс этой группы было практически таким же как в контроле. В группе крыс, получавших в дополнение к стандартному рациону милиацин, содержание НЭЖК И ТАГ было ниже, чем в контроле соответственно на 10% и 46%.

Таблица 2 - Влияния милиацина на некоторые микроскопические показатели кала у крыс

Группы животных, (n=20)	I препарат с суданом	II препарат с метиловым синим		Отношение, M±m
	Показатели, число капель, M±m
	НЭЖК+ТАГ	НЭЖК	ТАГ	НЭЖК/НЭЖК +ТАГ	ТАГ/НЭЖК +ТАГ
Интактные	18,7±1,31	11,85±0,6	6,86±0,45	0,63±0,03	0,34±0,02
ДПК	16,5±0,86*	9,83±0,6*	6,67±0,49	0,6±0,03	0,4±0,02
Милиацин	14,2±1,07*	10,6±0,85	3,6±0,23*	0,76±0,05	0,25±0,01*
ДПК + Милиацин	18,75±1,22*	14±0,98*	2,75±0,17*	0,83±0,04*	0,16±0,01*

Примечание: * P≤0,01 (в сравнении с контролем, различия достоверны)

Наконец, введение в пищевой рацион животных сочетано маргарина и милиацина привело к повышению содержания в кале НЭЖК на 18%, на фоне снижения содержания ТАГ на 40%, в сравнении с контрольной группой. По сравнению с группой животных, получавших маргарин, содержание жира в группе милиацин и ДПК было на 42% выше для НЭЖК и на 58% ниже, для ТАГ. В итоге отношение НЭЖК/НЭЖК+ТАГ в группе милиацин и ДПК было на 31% выше, чем в контроле и в группе крыс, получавших маргарин, а отношение ТАГ/НЭЖК+ТАГ было на 52% ниже, чем в контрольной группе и группе на диете с умеренным повышением калорийности.

Обсуждение результатов

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что даже незначительное, на 10% от суточного рациона, повышение калорийности диеты за счет включения в суточный рацион животных дополнительного количества нейтрального жира, в виде маргарина, оказывало умеренный обесогенный эффект. Этот эффект проявилсяизменениями в липидном спектре крови, которые характеризовались гиперхолестеринемией, с одновременным снижением уровня ЛПВП, а также более высоким уровнем триацилглицеринов. Подобные изменения характерны для дислипопротеинемий, наблюдаемых при ожирении [11, С.1-10], [12, С.157-164], [13, С.140-149], [16, С.15229-1530]. Применение растительного тритерпеноида милиацина само по себе не приводило к изменению показателей липидного спектра, но в сочетании с потреблением маргарина ограничивало развитие гиперхолестеринемии и дислипопротеинемии, характерные для ожирения.

Анализ результатов микроскопического исследования кала показывает, что поступление в организм тритерпеноида милиацина на фоне диеты с умеренным повышением калорийности приводило к увеличению содержания в кале НЭЖК, вместе с тем, концентрация в кале ТАГ уменьшалось. Увеличение уровня неэтерифицированных жирных кислот в кале животных может свидетельствовать о процессах нарушения их адсорбции. Подобного рода явление может быть связано с тем, что милиацин не угнетает работу липолитических ферментов желудочно-кишечного тракта, а его обессогенное действие, вероятнее всего, связано с нарушением адсорбции НЭЖК в структуре мицелл. Поскольку поступающие в избытке НЭЖК не всасываются, их количество в кале увеличивается. В итоге происходит уменьшение поступления калорий в организм, что положительно влияет на показатели липидного обмена в сыворотке крови.

Заключение

Таким образом, преимущества использования милиацина для профилактики гиперхолестеринемий и дислипопротеинемий считаем перспективным как с точки зрения показанной экспериментальной эффективности, низкой токсичности, так и с точки зрения доступности сырья. Результаты исследования расширяют представления о диапазоне биологических эффектов милиацина, как перспективного средства для коррекции липидного профиля как при нормальном питании, так и в случаях незначительного повышения калорийности пищевого рациона.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Вербовой, А.Ф. Адипонектин: биологические и патофизиологические эффекты / А.Ф. Вербовой, А.В. Пашенцева, Л.А. Шаронова // Врач. - 2016. - № 8. - С. 12–15.
2. Калинина О.В. Природный тритерпеноид милиацин предотвращает вызванный метотрексатом окислительный стресс и нормализует экспрессию генов cyp-2e1 и глутатионредуктазы в печени / О.В. Калинина и др. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2013.- Т.57, №1. - С.70-74.
3. Нузов Б.Г. Пути улучшения результатов лечения острого тромбофлебита поверхностных вен нижних конечностей / Б.Г. Нузов, А.А. Стадников, В.И. Бородин // Анн.травм.и ортопедии, 2001. - № 2. - С. 50-51.
4. Олифсон Л.Е. Химическая природа и биологическая активность милиацина / Л.Е. Олифсон, Н.Д. Осадчая, Б.Г. Нузови др. // Вопросы питания, 1991. - № 2. - С. 37-59.
5. Панфилова Т.В. Влияние тритерпеноида милиацина на чувствительность лимфоцитов тимуса и селезенки к апоптозу, индуцированному дексаметазоном / Т.В. Панфилова, А.А. Штиль, Е.Р. Полосухинаи др. // Бюлл. экспер. биол. и мед., 2003. - Т. 136. - № 10. - С. 382-385.
6. Панфилова Т.В. Тритерпеноид милиацин снижает индуцированное стрессом ПОЛ / Т.В. Панфилова, А.А. Штиль, Б.А. Фролов // Бюлл. экспер. биол. и мед., 2006. - Т. 141. - № 6. - С. 633-635.
7. Патент на изобретение РФ №2020100797/14(001103). «Способ профилактики и снижения инсулинорезистентности у лабораторных животных». Красиков С.И., Ким В.И., Шарапова Н.В., Петрова А.А., Карманова Д.С., Дерябина Н.И., Судакова Э.А., Баскаков К.Э. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 17 апреля 2020 г.
8. Патент РФ на изобретение № 1043860. «Средство, стабилизирующее биологические мембраны. Чернов А.Н., Павлова М.М., Олифсон Л.Е., 1983
9. Патент на изобретение РФ №2724891. «Способ снижения гемотоксического действия бензола на организм». Шарапова Н.В., Красикова П.С., Красиков С.И., Боев В.М., Петрова А.А. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 26 июня 2020 г.
10. Фролов Б.А. Защитный эффект милиацина при экспериментальной сальмонеллезной инфекции / Б.А. Фролов, И.Н. Чайникова, А.Д. Железноваи др. // ЖМЭИ, 2013б. - № 6. - С. 3-8.
11. Фролов Б.А. Преодоление гепатотоксичности метотрексата: роль тритерпеноидов / Б.А. Фролов, О.В. Калинина, А.В. Кирилловаи др. // Клин. Онкогематология, 2013а. - Т. 6. - № 1. - С. 1-10.
12. Handjieva-Darlenska T. The effect of high-fat diet on plasma ghrelin and leptin levels in rats / T. Handjieva-Darlenska, N Boyadjieva. // J Physiol Biochem. – 2009. – Vol. 65(2).– P. 157-164.
13. Visceral fat mass determination in rodent: validation of dual-energy x-ray absorptiometry and anthropometric techniques in fat and lean rats / M. Gerbaix, L.Metz, E.Ringot et al. // Lipids Health Dis. – 2010. – Vol 9.– P. 140-149.
14. Klop B. Dyslipidemia in Obesity: Mechanisms and Potential Targets. / B. Klop, J.W.F. Elte, M.C. Cabezas. // Nutrients. –2013. –Vol. 5. –P. 1218-1240.
15. Vekic J. Obesity and dyslipidemia / J. Vekic, A. Zeljkovic, Aleksandra Stefanovic et al. // Metabolism. – 2019. –92. – P. 71-81.
16. Davis, S.N. Insulin, Oral Hypoglycemic Agents and the Pharmacology Endocrine Pancreas /S.N. Davis, D.K. Granner// In: Hardman, J.G. and Limbird, L.E., Eds., Goodman and Gilman’s T Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw Hill, New York. 2001. P.1526-1531.
17. Erah P.O. Hypoglycemic effect of the extract of Solenostemon monostachys leaves /P.O. Erah, G.E. Osuide, K.I. Omogbai // J. West Afr. Pharma. 1996. V.10. P.21-27.
18. Hawley S.A. The antidiabetic drug Metformin activates the AMP-activated protein kinase cascade via an adenine nucleotide-independent mechanism /S.A. Hawley, A.E. Gadalla, G.S. Olsen et al. // Diabetes. 2002, V.51. P.2420-2425.
19. Matthews D.R. Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man / D.R. Matthews et al. // Diabetologia. – 1985. – V. 28. №7. – P. 412-419.
20. Mainzen PrinceP. S.Hypoglycaemic and hypolipidaemic action of alcohol extract of Tinospora cordifolia roots in chemical induced diabetes in rats /P. Stanely Mainzen Prince, Venugopal P. Menon // Phytotherapy Research. 2003. V.17, Issue 4. P. 410-413.
21. Patent USA № 5691386. «Triterpenoid compound for the treatment of diabetes». Inman et al..25.11.1997.
22. Osegbe, I. Relationship between serum leptin and insulin resistance among obese Nigerian women / I. Osegbe, Okpara, E. Azinge // Ann. Afr. Med. - 2016. - Vol. 15, №1. - Р. 14–19.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Verbovoj, A.F. Adiponektin: biologicheskie i patofiziologicheskie jeffekty [Adiponectin: Biological and Pathophysiological Effects] / A.F. Verbovoj, A.V. Pashenceva, L.A. Sharonova // Vrach [Doctor]. - 2016. - № 8. - pp. 12–15. [in Russian]
2. Kalinina O.V. Prirodnyj triterpenoid miliacin predotvrashhaet vyzvannyj metotreksatom okislitel'nyj stress i normalizuet jekspressiju genov cyp-2e1 i glutationreduktazy v pecheni [The Natural Triterpenoid Miliacin Prevents Oxidative Stress Caused by Methotrexate and Normalizes the Expression of Cyp-2e1 and Glutathione Reductase Genes in the Liver] / O.V. Kalinina et al. // Patologicheskaja fiziologija i jeksperimental'naja terapija [Pathological Physiology and Experimental Therapy]. – 2013.- Vol.57, №1. - pp.70-74. [in Russian]
3. Nuzov B.G. Puti uluchshenija rezul'tatov lechenija ostrogo tromboflebita poverhnostnyh ven nizhnih konechnostej [Ways to Improve the Results of Treatment of Acute Thrombophlebitis of Superficial Veins of the Lower Extremities] / G. Nuzov, A.A. Stadnikov, V.I. Borodin // Ann.travm.i ortopedii [Annals of Traumatology and Orthopedics], 2001. - № 2. - pp. 50-51. [in Russian]
4. Olifson L.E. Himicheskaja priroda i biologicheskaja aktivnost' miliacina [Chemical Nature and Biological Activity of Miliacin] / L.E. Olifson, N.D. Osadchaja, B.G. Nuzov et al. // Voprosy pitanija [Nutrition Issues], 1991. - № 2. - pp. 37-59. [in Russian]
5. Panfilova T.V. Vlijanie triterpenoida miliacina na chuvstvitel'nost' limfocitov timusa i selezenki k apoptozu, inducirovannomu deksametazonom [The Effect of the Triterpenoid Miliacin on the Sensitivity of Thymus and Spleen Lymphocytes to Dexamethasone-Induced Apoptosis] / T.V. Panfilova, A.A. Shtil', E.R. Polosuhina et al. // Bjull. jeksper. biol. i med. [Bulletin of Experimental Biology and Medicine], 2003. - Vol. 136. - № 10. - pp. 382-385. [in Russian]
6. Panfilova T.V. Triterpenoid miliacin snizhaet inducirovannoe stressom POL [Triterpenoid Miliacin Inhibits Stress-Induced Lipid Peroxidation] / T.V. Panfilova, A.A. Shtil', B.A. Frolov // Bjull. jeksper. biol. i med. [Bulletin of Experimental Biology and Medicine], 2006. - Vol. 141. - № 6. - pp. 633-635. [in Russian]
7. Patent for Invention RF № 2020100797/14(001103). «Sposob profilaktiki i snizhenija insulinorezistentnosti u laboratornyh zhivotnyh» [Method of Preventing and Reducing Insulin Resistance in Laboratory Animals]. / Krasikov S.I., Kim V.I., Sharapova N.V., Petrova A.A., Karmanova D.S., Derjabina N.I., Sudakova Je.A., Baskakov K.Je. Registered in the State Register of Inventions of the Russian Federation on April 17, 2020. [in Russian]
8. Patent for Invention RF № 1043860. «Sredstvo, stabilizirujushhee biologicheskie membrany» [Biological Membrane Stabilizing Agent]. / Chernov A.N., Pavlova M.M., Olifson L.E., 1983 [in Russian]
9. Patent for Invention RF № 2724891. «Sposob snizhenija gemotoksicheskogo dejstvija benzola na organizm» [Method for Reducing the Hemotoxic Effect of Benzene on the Body]. / Sharapova N.V., Krasikova P.S., Krasikov S.I., Boev V.M., Petrova A.A. Registered in the State Register of Inventions of the Russian Federation on June 26, 2020. [in Russian]
10. Frolov B.A. Zashhitnyj jeffekt miliacina pri jeksperimental'noj sal'monelleznoj infekcii [Protective Effect of Miliutina in Experimental Salmonella Infection] / B.A. Frolov, I.N. Chajnikova, A.D. Zheleznova et al. // ZhMJeI [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology], 2013b. - № 6. - pp. 3-8. [in Russian]
11. Frolov B.A. Preodolenie gepatotoksichnosti metotreksata: rol' triterpenoidov [Overcoming Hepatotoxicity of Methotrexate: The Role of Triterpenoids] / B.A. Frolov, O.V. Kalinina, A.V. Kirillova et al. // Klin. Onkogematologija [Clinical Oncohematology], 2013a. - Vol. 6. - № 1. - pp. 1-10. [in Russian]
12. Handjieva-Darlenska T. The effect of high-fat diet on plasma ghrelin and leptin levels in rats / T. Handjieva-Darlenska, N Boyadjieva. // J Physiol Biochem. – 2009. – Vol. 65(2).– P. 157-164.
13. Visceral fat mass determination in rodent: validation of dual-energy x-ray absorptiometry and anthropometric techniques in fat and lean rats / M. Gerbaix, L.Metz, E.Ringot et al. // Lipids Health Dis. – 2010. – Vol 9.– P. 140-149.
14. Klop B. Dyslipidemia in Obesity: Mechanisms and Potential Targets. / B. Klop, J.W.F. Elte, M.C. Cabezas. // Nutrients. –2013. –Vol. 5. –P. 1218-1240.
15. Vekic J. Obesity and dyslipidemia / J. Vekic, A. Zeljkovic, Aleksandra Stefanovic et al. // Metabolism. – 2019. –92. – P. 71-81.
16. Davis, S.N. Insulin, Oral Hypoglycemic Agents and the Pharmacology Endocrine Pancreas /S.N. Davis, D.K. Granner // In: Hardman, J.G. and Limbird, L.E., Eds., Goodman and Gilman’s T Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw Hill, New York. 2001. P.1526-1531.
17. Erah P.O. Hypoglycemic effect of the extract of Solenostemon monostachys leaves /P.O. Erah, G.E. Osuide, K.I. Omogbai // J. West Afr. Pharma. 1996. V.10. P.21-27.
18. Hawley S.A. The antidiabetic drug Metformin activates the AMP-activated protein kinase cascade via an adenine nucleotide-independent mechanism /S.A. Hawley, A.E. Gadalla, G.S. Olsen et al. // Diabetes. 2002, V.51. P.2420-2425.
19. Matthews D.R. Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man / D.R. Matthews et al. // Diabetologia. – 1985. – V. 28. №7. – P. 412-419.
20. Mainzen PrinceP. S. Hypoglycaemic and hypolipidaemic action of alcohol extract of Tinospora cordifolia roots in chemical induced diabetes in rats /P. Stanely Mainzen Prince, Venugopal P. Menon // Phytotherapy Research. 2003. V.17, Issue 4. P. 410-413.
21. Patent USA № 5691386. «Triterpenoid compound for the treatment of diabetes». Inman et al..25.11.1997.
22. Osegbe, I. Relationship between serum leptin and insulin resistance among obese Nigerian women /I. Osegbe, Okpara, E. Azinge // Ann. Afr. Med. - 2016. - Vol. 15, №1. - Р. 14–19.