Pages Navigation Menu

ISSN 2227-6017 (ONLINE), ISSN 2303-9868 (PRINT), DOI: 10.18454/IRJ.2227-6017
ПИ № ФС 77 - 51217, 16+

DOI: https://doi.org/10.18454/IRJ.2016.53.037

Скачать PDF ( ) Страницы: 176-177 Выпуск: № 11 (53) Часть 3 () Искать в Google Scholar
Цитировать

Цитировать

Электронная ссылка | Печатная ссылка

Скопируйте отформатированную библиографическую ссылку через буфер обмена или перейдите по одной из ссылок для импорта в Менеджер библиографий.
Щербакова Н. С. ENV-ПСЕВДОВИРУСЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А1 И CRF63_02A1 / Н. С. Щербакова, Л. В. Султанов, В. А. Лукьянова и др. // Международный научно-исследовательский журнал. — 2016. — № 11 (53) Часть 3. — С. 176—177. — URL: https://research-journal.org/medical/env-psevdovirusy-vich-1-subtipa-a1-i-crf63_02a1/ (дата обращения: 11.08.2020. ). doi: 10.18454/IRJ.2016.53.037
Щербакова Н. С. ENV-ПСЕВДОВИРУСЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А1 И CRF63_02A1 / Н. С. Щербакова, Л. В. Султанов, В. А. Лукьянова и др. // Международный научно-исследовательский журнал. — 2016. — № 11 (53) Часть 3. — С. 176—177. doi: 10.18454/IRJ.2016.53.037

Импортировать


ENV-ПСЕВДОВИРУСЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А1 И CRF63_02A1

Щербакова Н.С.1, Щербаков Д.Н.1, Султанов Л.В.2, Лукьянова В.А.2, Новикова О.А.2, Булатова Т.Н.3, Айкин С.С.3, Москалева Н.В.3, Конончук О.Н.3

1ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская область, 2КГБУЗ «Алтайский краевой центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями», г. Барнаул, 3ГБУЗ КО «Кемеровский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями», г. Кемерово

ENV-ПСЕВДОВИРУСЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А1 И CRF63_02A1

Аннотация

Самая главная характеристика гуморального ответа на введение вакцины – нейтрализующая активность. В настоящее время широко используется метод нейтрализации env-псевдовирусов ВИЧ-1 с применением клеток TZM-bl. Поэтому cоздание и характеризация панелей псевдовирусов разных субтипов ВИЧ-1 является актуальной задачей.

Из сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов был амплифицирован полноразмерный ген envelope. Были сконструированы плазмиды pEnv и получены функциональные псевдовирусы. При помощи филогенетического анализа было показано, что 6 из полученных псевдовирусов относятся к CRF63_02A1 и 2 – к субтипу А1.

Таким образом, были получены 8 env-псевдовирусов ВИЧ-1 субтипов, распространенных на территории Западной Сибири.

Ключевые слова: ВИЧ-1, envпсевдовирусы ВИЧ-1, нейтрализация, TZM-bl.

Shcherbakova N.S.1, Shcherbakov D.N.1Sultanov L.V.2, Lukyanova V.A.2, Novikova O.A.2, Bulatova T.N.3, Aykin С.С.3, Moskaleva N.V.3, Konchuk О.N.3

1SRC VB “Vector”, Koltsovo, Novosibirsk region, 2RSBH «Altay Regional Center for Prevention and Control of AIDS and Infectious Diseases», Barnaul, 3SBHA KR «Kemerovo Regional Center for Prevention and Control of AIDS and Infectious Diseases», Kemerovo

ENV-PSEUDOVIRUSES OF HIV-1 SUBTYPE A1 AND CRF63_02A1

Abstract

Neutralizing activity is the most important feature of humoral response. Nowadays method of neutralization of env-pseudoviruses of HIV-1 using TZM-bl cells is widely used. So, creation and characterization of env-pseudoviruses panels of different subtypes is important goal.

Full envelope gene was amplified from HIV+ serum. Plasmids pEnv were constructed and functional pseudoviruses were received. Using phylogenetic analysis, it was shown that 6 pseudovirus belong to CRF63_02A1 and 2 to subtype A1.

Thus, 8 env-pseudoviruses of HIV-1 subtype prevalent in Western Siberia were created.

Keywords: HIV-1, env-pseudoviruses of HIV-1, neutralization, TZM-bl.

В ответ на попадание в организм чужеродных антигенов, организм отвечает выработкой антител, нейтрализующих их активность. Аналогично, в ответ на введение вакцины в организме вырабатываются антитела, обладающие нейтрализующей активностью. Для оценки эффективности вакцины, необходим метод, адекватно и чувствительно анализирующий in vitro наличие или отсутствие нейтрализующих антител.

Существует множество подходов для оценки вируснейтрализующих свойств сывороток, они отличаются по типам используемых клеток и вирусов, по методам детекции результата и по тому, сколько раундов инфекции используется: один или множество [1]. В настоящее время широко применяется псевдовирусная система оценки нейтрализующих свойств сыворотки с использованием генетически-инженерных клеток TZM-bl [2]. TZM-bl (JC53BL-13) – генетически модифицированн клеточную линию HeLa, которая презентирует на своей поверхности большое число рецепторов ВИЧ-1 (CD4, CCR5, CXCR4) и содержит репортерные гены люциферазы светлячка и β-галактазидазы под контролем Tat-индуцируемого промотора [2].  При заражении клеток TZM-bl псевдовирусами, белок Tat ВИЧ-1 индуцирует ген люциферазы светлячка (Luc) и клетки испускают люминисценцию. По уровню люминисценции можно судить об инфицировании клеток.

Псевдотипированные вирусы – это рекомбинантные вирусные частицы, которые физиологически практически идентичны природным ВИЧ-1, но биологически безопасны. Благодаря наличию комплекса поверхностных гликопротеинов gp120-gp41 они способны однократно инфицировать клетки, несущие рецепторы CD4+ и CCR5/X4, но из-за дефектного генома не способны к дальнейшему размножению. Благодаря такой особенности псевдовирусы называют вирусами одного цикла инфекции и работа с ними безопаснее для исследователя. Env-псевдотированная вирусная система чувствительна, воспроизводима, обладает корреляционностью, она может быть оптимизирована и валидирована под стандарты GLP, GMP, GCLP для проведения клинических испытаний на людях, все реагенты могут быть стандартизованы, и, наконец, метод и все реагенты можно передавать между лабораториями и воспроизводить результаты.

Плазмидные env клоны стабильны, хорошо охарактеризованы, у них известна нуклеотидная последовательность, они могут быть легко и быстро переданы из лаборатории в лабораторию. Использование env-экспрессирующих плазмид для производства Env-псевдотипированных вирусов гарантирует, что в любое время в лаборатории может быть произведено достаточное количество псевдовирусов с определенным генотипом. Использование в исследованиях определенной панели псевдовирусов снижает время для проведения анализа и позволяет валидировать метод.

Задачей нашего исследования было получить панель псевдовирусов субтипов A1 и CRF63_02A1, распространенных в Западной Сибири.

Для этого, были взяты 10 сывороток ВИЧ-инфцированных из ГБУЗ «Кемеровский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» и 10 сывороток от Алтайского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями. Из сывороток была выделена мРНК ВИЧ-1. Для получения кДНК с мРНК была проведена полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с последующей гнездовой ПЦР на полноразмерный ген envelope. Амплифицированные фрагменты полноразмерного гена env были очищены из агарозного геля при помощи набора MinElute CEL Extraction kit (Qiagen), согласно инструкции, и клонированы в составе векторной плазмиды pcDNA™3.1/V5-HisTOPO®TA (Invitogen). Полученными рекомбинантными плазмидами pEnv были трансформированы компетентные клетки E.coli Stbl2. Отбор клонов, содержащих вставку, проводили методом ПЦР. Отобранные клоны, несущие вставку, нарабатывались в культуре клеток E.coli Stbl2. Выделение и очистку плазмид проводили на наборе QIAprep® Miniprep (Qiagen). Выход плазмид обычно составлял 300-500 нг/мкл. Последовательность гена env подтверждали секвенированием.

Псевдовирусы получали магнитной ко-трансфекцией (MATra, PromoKine) эукаратиотических клеток 293Т двумя видами плазмид в эквимолярных концентрациях: полученной нами pEnv-CRF63_02A1, кодирующей оболочечные белки ВИЧ-1, и pSG3Δenv (backbone-плазмида), кодирующей остальные белки ВИЧ-1, за исключением Env. В качестве контроля эффективности ко-трансфекции была проведена параллельная трансфекция клеток плазмидой, содержащей ген белка GFP. Клетки культивировали в 24-луночных планшетах в ростовой среде DMEM, содержащей 10% сыворотку плодов коровы, 600 мкг/мл глютамина и 50 мкг/мл гентамицина. Через сутки эффективность трансфекции определяли по площади флюоресценции в контрольных лунках, псевдовирусы концетировали путем смены ростовой среды в объеме 50% от исходного количества. Через 48 часов после ко-трансфекции собирали супернатант, содержащий псевдовирусы, и центрифугировали в микро пробирках 10 мин при 1000 об/мин для осаждения клеточного дебриса. 200 мкл супернатанта каждого псевдовируса оставляли для последующего определения функциональной активности псевдовирусов, а остальное количество аликвотили и хранили при -80°С.

Функциональную активность псевдовирусов определяли в клетках TZM-bl. 50 мкл псевдовирус-содержащего супернатанта вносили в лунку 96-луночного культурального планшета к монослою клеток. Для каждого псевдовируса анализ проводили в четырех повторах. Через 48 часов определяли функциональность псевдовирусов (способность заражать клетки) по уровню люминисценции. Люциферазную активность определяли при помощи реагента Luciferase Assay Reagent (Promega). Для этого после удаления ростовой среды с клеток, их однократно промывали PBS и лизировали при помощи Luciferase Cell Culture Lysis buffer (Promega). 10 мкл лизата переносили в оптические планшеты и добавляли по 50 мкл Luciferase Assay Reagent в каждую лунку. Уровень люминисценции измеряли на приборе Wallac 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) в течение 10 сек на каждую лунку. Клоны псевдовирусов отбирались как функциональные и пригодные для анализа нейтрализации при уровне люминисценции превышающей пороговый сигнал, как минимум, в 50 раз.

Для определения субтипа вируса, проводили построение филогенетических деревьев методом максимального правдоподобия при помощи программы RAxML. В качестве референс-последовательностей использовали ранее охарактеризованные последовательности субтипов и групп ВИЧ-1. Рекомбинацию изучали, используя программу SimPlot версия 3.5 с интервалом в 200 п.н. с построением филогенетического дерева методом присоединения соседей (двух-параметрная модель Кимуры). Достоверность филогенетических отношений определяли методом бутстреп-анализа.

Было определено, что 6 полученных нами псевдовирусов относятся к рекомбинантной формы CRF63_02A1, а 2 – к субтипу А1, которые широко распространены на территории Западной Сибири.

Таким образом, в результате работы нами были получены 8 envпсевдовирусов ВИЧ-1 субтипов, распространенных на территории СФО. Данные псевдовирусы можно использовать при исследовании антиретровирусных препаратов и вируснейтрализующих свойств сывороток.

Работа была выполнена при поддержке гранта РФФИ 16-34-00338 мол_а.

Список литературы на английском языке / References in English

  1. Fenyö E.M., Heath A., Dispinseri S., Holmes H., Lusso P., Zolla-Pazner S., Alcami J., Scarlatti G. International network for comparison of HIV neutralization assays: The NeutNet report. // PloS one. – 2009. V. 4(2). P. e4505.
  2. Montefiori D. Measuring HIV Neutralization in a Luciferase Reporter Gene Assay. – NY.: Humana Press, 2009. – P. 395-405.

Оставить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Лимит времени истёк. Пожалуйста, перезагрузите CAPTCHA.