CHANGES IN TP53 SUPPRESSOR GENE EXPRESSION IN RAT TISSUES IN EXPERIMENTAL ASCARIASIS AT DIFFERENT OBSERVATION PERIODS DURING REPRODUCTION OF THE RAT GLIOMA C6 TUMOR MODEL IN SITU

Одним из важнейших генов-супрессоров, контролирующих перерождение нормальной клетки в опухолевую, является ген TP53. Его биологическая роль заключается в обеспечении стабильности генома и генетической однородности клеток в целостном организме. В ходе роста и деления нормальных клеток постоянно происходит накопление нарушений первичной структуры ДНК в результате естественного мутагенеза или ошибок в процессе ее удвоения (репликации ДНК). Специальная система для их устранения, включающая цепь репаративных белков, работает в определенных фазах клеточного цикла [1], [2].

Белок р53 является продуктом гена-супрессора опухоли TP53 и экспрессируется во всех клетках организма. При отсутствии повреждений генетического аппарата белок р53 находится в неактивном состоянии, а при появлении повреждений ДНК активируется [3], [4].

Показано, что индукция Тр53 вызывает задержку клеточного цикла с последующей репарацией повреждений или естественную гибель клеток, препятствуя, таким образом, нарушению целостности генома и приобретению опухолевого фенотипа. Именно поэтому ген Тр53 часто называют «страж генома», «ангел-хранитель», «ген совести клетки», а мутантный ген – «падший ангел».

У клеток с дефектным или отсутствующим геном Тр53 контрольный пункт G1/S фазы митоза неполноценен, в результате чего в популяции накапливаются клетки с множественными нарушениями структуры ДНК; возникает нестабильность генома. При этом появляются все новые клоны клеток. Их естественный отбор лежит в основе опухолевой прогрессии, клетки становятся все менее чувствительными к действию цитостатиков, все больше нарушается контактное взаимодействие клеток, возникает метастазирование.

Мутации этого гена могут быть сопряжены с агрессивным течением заболевания и устойчивостью опухолевых клеток к воздействию противоопухолевых лекарств и лучевой терапии. Появление мутантного Тp53 в ткани опухоли обнаруживается уже на ранних стадиях болезни. Установлено также, что наиболее часто экспрессия мутантного Тp53 наблюдается при серозной цистаденокарциноме (57,9%) и сравнительно реже отмечается при эндометриоидной (25,6%), муцинозной аденокарциноме (22 %). По данным многих авторов высокая экспрессия белка p53 коррелирует с низкой общей выживаемостью [5], [6], [7].

Агрессивные метаболиты, выступающие в роли проканцерогенов, могут быть физической, химической и биологической природы. Они способны прочно связываться с участками молекулы ДНК.

Аскарида человеческая – геогельминт, паразитирование которого и вызывает заболевание «аскаридоз». Аскаридоз выявляется у ¼ населения мира. Это заболевание распространено в большинстве стран среднего Востока, Африке, Северной Америке, Новой Зеландии, Австралии, Северной Европе, Индии, Турции. По оценкам ВОЗ аскаридами инвазировано более одного миллиарда человек.

Известно, что при паразитировании гельминта может развиться реакция гиперчувствительности немедленного типа, что проявляется токсико-аллергическими явлениями: кашлем, ринитом, отеком Квинке, крапивницей, кожным зудом, повышением уровня Ig E в крови.

Напряженность иммунного ответа организма хозяина изменяется в зависимости от стадии развития паразита. Это связано со сменой антигенного спектра и иммуногенных свойств гельминта, который претерпевает метаморфоз в течение биологического цикла. Наиболее выражен иммунный ответ в миграционную стадию. Одной из важных причин органных и системных поражений является образование иммунных комплексов, которые активируют систему комплемента и цитокины. Однако, несмотря на напряженность иммунного ответа хозяина, гельминты оказывают иммуносупрессивное действие, что способствует их адаптации и выживанию в организме. В итоге возникает иммунодефицитное состояние, способствующее снижению резистентности инвазированного организма к бактериальным, вирусным и другим инфекциям, что может приводить к их затяжному течению, развитию осложнений и формированию носительства.

Кроме того, в местах паразитирования гельминты наносят механическое повреждение, вызывая раздражение и воспалительные реакции. Их скопление может приводить к возникновению объемных образований, вызывающих сдавливание жизненно важных органов хозяина с соответствующей клинической картиной и тяжелыми последствиями.

Одним из значимых патогенетических механизмов развития заболевания является поглощение паразитами питательных веществ из полости кишечника: продуктов переваривания белков, липидов и углеводов, витаминов и микроэлементов.

Показано, что в клинической картине гельминтозов нередко преобладают вегетативные и неврологические симптомы. Вегетативные нарушения нервной системы проявляются в виде изменений дермографизма, повышенного слюноотделения, ночного недержания мочи.

Известны случаи отягощения аскаридозом различных инфекционных и неинфекционных заболеваний. Зафиксированы наблюдения о более тяжелом течении туберкулеза, дифтерии, атопического дерматита, бронхиальной астмы, развитие злокачественных новообразований [8], [9], [10], [11].

Таким образом, действие аскаридного аллергена, развитие неспецифического синдромокомплекса интоксикации, аллергизации, иммунодепрессии, дисбиоза кишечника создает благоприятный фон для возникновения соматической (в том числе опухолевой) патологии.

В связи с вышеизложенным исследования по влиянию воздействий гельминтов класса нематод на процесс изменения экспрессии антионкогена TP53 у млекопитающих позволит определить их роль в молекулярно-генетических механизмах канцерогенных процессов. Кроме того, фундаментальные исследования, направленные на изучение молекулярно-генетических аспектов экспресии и репрессии антионкогенов, могут помочь в разработке более эффективных методов лечения со стратегией комплексной антиангиогенной терапии, включая ингибирование альтернативных проангиогенных путей совместно с антиинвазивными препаратами, препятствующими локальной инвазии и метастатическому распространению.

Целью настоящего исследования служило изучение и анализ изменения экспрессии гена-супрессора TP53 в тканях экспериментальных крыс при аскаридозе на различных сроках наблюдения во время воспроизведения опухолевой модели глиомы крыс С6 in situ.

Для достижения поставленной цели было воспроизведено 2 серии эксперимента. В качестве контроля (незараженные животные с глиомой) использовали 40 самок крыс линии Wistar, которых  разделяли на 4 группы по 10 особей в каждой. Животным проводили подкожное введение опухолевых клеток крысиной глиомы С6 для воспроизведения опухоли по разработанному нами способу [12]. Самок крыс умерщвляли под воздействием эфирного наркоза на 14-е, 21-е, 28-е, 35-е сутки развития опухоли и проводили забор материала (опухоль) для определения экспрессии гена-супрессора TP53 в сравнении с генами референсами ‑ β-актином (ACTB) и GAPDH. Результаты использовали как «контроль с опухолью».

Во второй серии изучали воздействие гельминтов при воспроизведении экспериментальной глиомы in situ, в зависимости от срока развития аскарид в организме хозяина и дозы заражения, использовали 40 самок крыс линии Wistar. Животных разделяли на 4 группы по 10 особей в каждой. Самкам всех групп проводили введение опухолевых клеток крысиной глиомы С6 по разработанному способу подкожно. На 7-е сутки после введения опухолевых клеток, самок заражали в дозе 20 яиц A. suum на 1 грамм массы тела животного. На 7-е сутки, после заражения, а также на 14-е, 21-е, 28-е сутки крыс умерщвляли путем дислокации шейных позвонков под воздействием эфирного наркоза и проводили забор материала (опухоль, печень, легкие, головной мозг).

Анализ экспрессии проводился Real-Time PCR программой qbase+. Результат нормализованной экспрессии рассчитывали с учетом соотношения анализируемого антионкогена к референсным генам ACTIN-β (ACTB) и GAPDH.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 10.0. Результаты в тексте отображали в виде средней и ДИ. Различия считали достоверными при уровне значимости  менее 0,05 (р<0,05).

В группе животных первой серии «контроль с опухолью» выявлено, что в тканях опухоли экспрессия гена-супрессора TP53 на 14-е сутки составила 0,34 относительных единицы (95% ДИ: 0,24-0,47), на 21-е ‑ 0,26 (95% ДИ: 0,19-0,35), 28-е ‑ 0,38 (95% ДИ: 0,32-0,46), а на 35-е суки ‑ 0,27 относительных единиц (95% ДИ: 0,20-0,38).

В свою очередь, уровень экспрессии TP53 в лёгких составил к 14-м суткам 0,19 относительных единиц (95% ДИ: 0,13-0,30), к 21-м ‑ 0,11 (95% ДИ: 0,045-0,26), к 28-м ‑ 0,13 (95% ДИ: 0,051-0,34), к 35-м ‑ 0,10 (95% ДИ: 0,037-0,27) относительных единиц.

В тканях печени экспрессия TP53 к 14-м суткам находилась на уровне 0,16 (95% ДИ: 0,12-0,22), к 21-м ‑ 0,18 (95% ДИ: 0,11-0,28), к 28-м ‑ 0,18 (95% ДИ: 0,098-0,34), к 35-м ‑ 0,22 (95% ДИ: 0,15-0,31) относительных единиц.

В биоптатах головного мозга экспрессия TP53 на 14-е сутки составила 0,16 (95% ДИ: 0,12-0,21), на 21-е ‑ 0,18 (95% ДИ: 0,12-0,25), 28-е сутки ‑ 0,20 (95% ДИ: 0,12-0,33), на 35-е сутки ‑ 0,21 (95% ДИ: 0,13-0,34) относительных единиц.

Экспрессия TP53 в опухолевой ткани глиомы животных, зараженных в дозе 20 яиц аскарид на 1 г массы тела, к 7-м суткам развития паразита составила 0,45 относительных единиц (95% ДИ: 0,35-0,57), к 14-м суткам ‑ 0,37 (95% ДИ: 0,29-0,47), к 21-м ‑ 0,50 (95% ДИ: 0,44-0,57), а к 28-м ‑ 0,39 (95% ДИ: 0,31-0,49) относительных единиц.

Выявлено достоверное отличие в сторону повышения при сравнении с неинвазированными животными с глиомой (1 серия) на всех этапах наблюдения (p=0,0091-0,049).

В биоптатах легких показатели TP53 зафиксированы на следующих уровнях: 7-е сутки ‑ 0,40 относительных единицы (95% ДИ: 0,19-0,57), 14- сутки после заражения ‑ 0,34 (95% ДИ: 0,049-0,41), 21-е сутки ‑ 0,41 (95% ДИ: 0,058-0,62), 28-е сутки ‑ 0,46 (95% ДИ: 0,053-0,54) относительных единиц.

Отмечалось повышение экспрессии исследуемого гена TP53 на всех сроках развития гельминта по сравнению с первой серией (p=0,0002-0,04).

Экспрессия TP53 в печени самок экспериментальных самок к 7-м суткам составила 0,33 относительных единицы (95% ДИ: 0,15-0,45), к 14-м ‑ 0,42 (95% ДИ: 0,11-0,53), к 21-м ‑ 0,40 (95% ДИ: 0,11-0,52), к 28-м ‑ 0,30 (95% ДИ: 0,14-0,35) относительных единицы. Сравнение с данными группы неинвазированных животных с глиомой показало рост экспрессии на всех этапах (p=0,0002-0,041).

В свою очередь, выраженность экспрессии изучаемого антионкогена в головном мозге составила на 7-е сутки после инвазии ‑ 0,33 (95% ДИ: 0,20-0,36), на 14-е сутки ‑ 0,36 (95% ДИ: 0,13-0,41), на 21-е ‑ 0,33 (95% ДИ: 0,12-0,37), 28-е сутки ‑ 0,31 (95% ДИ: 0,14-0,33).

Анализ статистической значимости различий с уровнем экспрессии TP53 в ткани мозга второй серии показал достоверное отличие от результатов животных «контроль с опухолью» (p=0,0002-0,044).

Экспрессия TP53 в опухолевой ткани глиомы, легких, печени, головного мозга животных достоверно возрастает при заражении в дозе 20 яиц A. suum на 1 г массы тела животного по сравнению с данными серии «контроль с опухолью» на всех сроках развития паразита. Рост экспрессии TP53 говорит о том, что аскариды могут вызывать повреждение генетического аппарата клетки.

Белок р53 является продуктом гена-супрессора опухоли TP53 и экспрессируется во всех клетках организма. При отсутствии повреждений генетического аппарата белок р53 находится в неактивном состоянии, а при появлении повреждений ДНК активируется. Белок р53 активирует транскрипцию гена ВАХ и аналогичных ему генов, которые ингибируют белки, оказывающие антиапоптотическое действие. Выявленная индукция Тр53 направлена на задержку клеточного цикла для последующей репарации повреждений или естественную гибель клеток, препятствуя, таким образом, нарушению целостности генома и приобретению опухолевого фенотипа.