EFFECTS OF NEMATHELMINTHES- AND APICOMPLEXA TYPE PARASITIC AGENTS ON THE EXPRESSION PROCESS OF PROTONCOGENES IN THE EXPERIMENT

Известно, что паразитарные заболевания распространены повсеместно. Причиной таковых являются одноклеточные и многоклеточные паразиты и их воздействие на организм хозяина. Проблема борьбы с паразитозами имеет важное биологическое, медицинское и социально-экономическое значение. Влияние гельминтов и протист, как паразитарных агентов биологического характера, характеризуется довольно сложными патологическими проявлениями различной степени тяжести [1], [2]. В проведенных исследованиях, посвященных оценке воздействия паразитов на организм хозяина, отмечается, что они могут синтезировать антигены хозяина для ослабления иммунного ответа, а также изменять процесс синтеза белка в зависимости от особенностей протеиногенеза у промежуточного и окончательного хозяев с образованием общих белковых антигенов [3]. За счет этого возможно угнетение функциональной и пролиферативной активности клеток лимфоидной ткани, что приводит к развитию вторичных иммунных дефицитов и способствует резкому изменению характера взаимоотношений в системе хозяин-паразит. При этом происходит супрессия иммунитета, подавление защитных свойств организма человека.

В настоящее время экспериментально показана способность некоторых паразитов, стимулировать развитие новообразований за счет механического воздействия. Установлено, что при описторхозе и клонорхозе чаще развивается рак печени [4], а у пациентов с мочеполовым шистосомозом в мочевом пузыре нередко образуются папилломы и возникает рак. Вопрос о влиянии паразитов на молекулярно-генетическом уровне до сих пор остается неизученным.

Известно, что абиотические и биотические факторы могут воздействовать на наследственный аппарат клетки [5], в результате чего может повреждаться ДНК или РНК, которые влияют на процесс деления клеток, апоптоз [6]. В процессе такого влияния за счет нарушения белкового синтеза путем воздействия на онкосупрессоры образуются «некачественные» клетки, которые могут дать начало запуску канцерогенных процессов [7], [8].

В балансе между пролиферацией и программируемой смертью клетки большую роль играют белки семейства IAP [9]. Одним из таких белков является сурвивин (BIRC5) [10]. Он участвует в контроле клеточного деления, регуляции апоптоза, ангиогенезе [11]. Избыточная экспрессия сурвивина вызывает резистентность опухолевых клеток к противоопухолевым агентам и ионизирующим излучениям [12]. Высокий уровень синтеза сурвивина в опухолях коррелирует с их прогрессией и считается негативным прогностическим фактором для некоторых опухолей [13]. Снижение или полная блокировка синтеза сурвивина способствует увеличению уровня апоптоза, что, в свою очередь, уменьшает потенциал роста опухоли и восстанавливает чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии [14].

Таким образом, изучение эффекта многоклеточных или одноклеточных представителей паразитов во время сформированного онкогенного процесса в эксперименте покажет, является ли значимой и нужной  разработка новых направлений и подходов к нейтрализации воздействия паразитарных агентов на молекулярно-генетическом уровне с целью достижения положительного эффекта лечения онкологических процессов.

Целью настоящего исследования служило изучение и анализ воздействия паразитарных агентов на процесс экспрессии протоонкогенов в эксперименте при сформированном онкологическом процессе.

Для достижения поставленной цели было воспроизведено 3 серии эксперимента. В качестве контроля (незараженные животные с глиомой) использовали 40 самок крыс линии Wistar, которых  разделяли на 4 группы по 10 особей в каждой. Животным проводили подкожное введение опухолевых клеток крысиной глиомы С6 для воспроизведения опухоли по разработанному нами способу [15]. Самок крыс умерщвляли под воздействием эфирного наркоза на 14-е, 21-е, 28-е, 35-е сутки развития опухоли и проводили забор материала (опухоль) для определения экспрессии протоонкогена сурвивина (BIRC5) в сравнении с генами референсами ‑ ACTIN-β (ACTB) и GAPDH. Результаты использовали как «контроль с опухолью».

Во второй серии изучали воздействие гельминтов на примере трихинелл на процесс экспрессии протонкогенов во время развития крысиной глиомы С6 in situ [15]. Крыс линии Wistar (40 голов) разделяли на 4 группы по 10 особей в каждой. На 7-е сутки после введения опухолевых клеток, самок четырех групп заражали в дозе 10 личинок на 1 г массы тела. Убой животных осуществляли путем дислокации шейных позвонков под воздействием эфирного наркоза по графику (7-е, 14-е, 21-е, 28-е сутки развития паразита, что соответствовало 14-м, 21-м, 28-м, 35-м суткам развития опухоли).

В третьей серии эксперимента осуществляли изучение роли одноклеточных паразитов с использованием токсоплазм в изменении экспрессии протоонкогенов сурвивина (BIRC5) при сформированном экспериментальном канцерогенном процессе, в тканях 40 самок крыс. Животных заражали перорально в дозе 25 тахизоитов токсоплазм на 1 г массы тела животного на 7-е сутки после введения опухолевых клеток глиомы С6 in situ. Забор материала (опухоль) осуществляли  по графику: на 14-е сутки развития глиомы (7-е сутки после инвазии), 21-е сутки развития опухоли (14-е сутки после инвазии), 28-е сутки развития опухоли (21-е сутки после инвазии), 35-е сутки развития глиомы (28-е сутки после инвазии).

Анализ экспрессии проводился Real-Time PCR программой qbase+. Результат нормализованной экспрессии рассчитывали с учетом соотношения анализируемого гена (BIRC5) к референсным генам ACTIN-β (ACTB) и GAPDH.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 10.0. Результаты в тексте отображали в виде средней и ДИ. Различия считали достоверными при уровне значимости  менее 0,05 (р<0,05).

В опухолевом материале животных серии «контроль с опухолью», экспрессия сурвивина (BIRC5) составила: на 14-е сутки ‑ 0,48 относительных единиц (95% ДИ: 0,35-0,66), на 21-е сутки ‑ 0,45 (95% ДИ: 0,33-0,62), к 28-м суткам ‑ 0,45 (95% ДИ: 0,34-0,60), а 35-м суткам ‑ 0,35 (95% ДИ: 0,23-0,54) относительных единиц.

В опухолевой ткани животных, инвазированных в дозе 10 личинок T. spiralis на 1 грамм массы тела животного сила экспрессии сурвивина (BIRC5) на 7-е сутки составила 0,72 относительных единиц (95% ДИ: 0,56-0,91), на 14-е сутки ‑ 0,70 (95% ДИ: 0,60-0,81), на 21-е ‑ 0,68 (95% ДИ: 0,58-0,80), на 28-е ‑ 0,66 (95% ДИ: 0,55-0,78) относительных единиц. Полученные результаты достоверно превышали экспрессию в ткани глиомы самок крыс первой серии эксперимента на всех сроках наблюдения (p=0,019-0,049).

В образцах третьей серии инвазия в дозе 25 тахизоитов токсоплазм на 1 г массы тела животного в тканях опухоли на 14-е сутки ее развития (7-е сутки после инвазии) была зафиксирована экспрессия сурвивина (BIRC5) на уровне 0,65 относительных единиц (95% ДИ: 0,607-0,698), на 21-е сутки развития опухоли (14-е сутки после инвазии) – 0,66 относительных единиц (95% ДИ: 0,639-0,696), на 28-е сутки развития опухоли (21-е сутки после инвазии) ‑ 0,51 относительных единиц (95% ДИ: 0,438-0,591), на 35-е сутки развития глиомы (28-е сутки после инвазии) ‑ 0,53 относительных единиц (95% ДИ: 0,399-0,675), что превышало результаты первой серии («контроль с опухолью») на всех этапах паразитирования токсоплазм (р=0,0173).

Анализ полученных данных при сравнении изменения силы экспрессии между сериями показал, что при заражении животных трихинеллой и токсоплазмой экспрессия сурвивина (BIRC5) показывает рост при сравнении с контрольной группой. Сравнение результатов, полученных в сериях №2 и №3 достоверных отличий не показало.

При анализе литературных источников аналогичных исследований не найдено. Полученный в эксперименте результат говорит о том, что паразитирование гельминтов типа Nemathelminthes класса Nematoda и паразитических представителей типа Apicomplexa класса Sporozoa может служить биологическим фактором, способным привести к активации, усилению экспрессии протоонкогенов, что в свою очередь вызовет интенсивный синтез онкобелков, а также прогрессию процесса канцерогенеза.