SELECTION OF BROOD FISH AND ACCOUNTING OF HEIGHT AND WEIGHT PARAMETERS IN RAINBOW TROUT OF A NEW BREEDING FORM - GOLDEN TROUT

Семейство лососевых рыб является одним из самых известных и экономически важных видов рыб в мире. Мясо лососевых является важным питательным пищевым продуктом для потребления человеком [1]. Аквакультура вносит значительный вклад в продовольственную и экономическую безопасность во многих странах [2], а также является предметом генетических исследований [3], [4]. Интерес представляет новое селекционное достижение – Ропшинская золотая форель, характеризующаяся привлекательной окраской чешуйчатого покрова  [5].

В последние годы особое внимание уделяется исследованию генома как ключевого фактора к пониманию функционирования клеток животных, растений и бактерий. Используется целый ряд методических подходов к расшифровке структуры генома, такие как изучение распределения микросателлитных ДНК в геноме [6], полиморфизм рестрикционных фрагментов ДНК [7] и секвенирование целого генома либо отдельных его участков [8]. Секвенирование генома атлантического лосося сыграло ключевую роль в понимании эволюционных и функциональных последствий, возникающих из-за наследственной дупликации целого генома, характерного для всех представителей семейства Salmonidae. Первым представителем семейства, высококачественная сборка генома которого была опубликована в 2016 году, был атлантический лосось (Salmo salar). Высокопроизводительное секвенирование изменило подход к изучению генетики лосося, в частности, упростило создание наборов маркеров. Генами, влияющими на рост и увеличение мышечной массы, являются LCORL и BMP-2 [9]. В хромосоме 24 расположен ген костного морфогенетического белка 2 (BMP-2), связанный с действием факторов роста, который играет роль в развитии тканей скелетных мышц Известно, что ген проявляет максимальную экспрессию в мышцах рыб семейства карповых. Полиморфизмы в этом гене связывают с формированием костей и размером скелета. Большинство животных несет одну копию гена BMP-2, в то же время костистые рыбы имеет две копии [10]. Ген LCORL у животных и рыб мало изучен. Этот ген кодирует лиганд-зависимый ядерный рецепторный корепсореподобный белок и является транскрипционным фактором. LCORL влияет не только на рост мышечной ткани у взрослой особи, но и на развитие мышц и скелета в эмбриогенезе.

Для выявления ассоциаций между полиморфными вариантами указанных генов и продуктивными характеристиками рыб необходимо создать базу данных, содержащую сведения о производителях и их потомках. Обобщение этих данных и сведение результатов бонитировки в базу данных явилось целью данной работы.

Объект исследования

Сбор биологического материала проводился на базе Федерального Селекционно-генетического центра рыбоводства, который расположен в поселке Ропша, Ленинградская область. Объектом исследования была популяция радужной форели породы ропшинская золотая. Для индивидуальной закладки икры на инкубацию были подобраны 17 пар производителей, количество изученных потомков составляло по 50 особей от каждой пары производителей (из 17 пар производителей потомство изучали от восьми пар). Самки были в возрасте четырех лет, а самцы в возрасте двух лет. Список сочетаний самок и самцов, от которых изначально планировалось получить потомство, представлен в таблице 1.

 Учет размерно-весовых показателей

От производителей во время бонитировки были взяты образцы биологического материала (кусок ткани), который был зафиксирован в 96% спирте.  Для закладки на инкубацию от самок было отобрано по 100 грамм икры. Осеменение производилось сухим методом. Далее икра была заложена в инкубационные аппараты. В процессе инкубации погибшая икра выбраковывалась. За время инкубации в двух семьях количество погибшей икры достигло 100%. Средняя температура инкубации составляла 9 °С. В процессе вылупления личинок и инкубационных рамок удалялась оболочка икры для избежания образования сапролегнии. К моменту перехода личинки на активное внешнее питание в 10 семьях из 18 оставшихся отход составил 100%.  С мальков от каждой семьи снимались метрические показатели (масса, длина по Смиту, длина до конца чешуйчатого покрова, длина головы, высота и толщина тела), с интервалом в месяц в течении полугода, для контроля роста и развития. При помощи мерной доски с самок были сняты размерно-весовые показатели (масса, длина по Смиту, длина до конца чешуйчатого покрова, длина головы, высота и толщина тела), а также репродуктивные показатели (вес икры, полученный от самки, масса одной икринки, количество икры в 5 граммах) на нерестовой бонитировке.

С самцов были взяты масса тела, длина по Смиту, объем эякулята, подвижность спермы (сек/%). От производителей во время бонитировки были взяты образцы биологического материала (кусок ткани), который был зафиксирован в 96% спирте. Для закладки на инкубацию от самок было отобрано по 100 грамм икры. Осеменение производилось сухим методом. Далее икра была заложена в инкубационные аппараты. В процессе инкубации погибшая икра выбраковывалась. За время инкубации в двух семьях количество погибшей икры достигло 100%. Средняя температура инкубации составляла 9°С. В процессе вылупления личинок из инкубационных рамок удалялась оболочка икры для избежания образования сапролегнии. К моменту перехода личинки на активное внешнее питание в 10 семьях из 18 оставшихся отход составил 100%.  С мальков от каждой семьи снимались метрические показатели (масса, длина по Смиту, длина до конца чешуйчатого покрова, длина головы, высота и толщина тела), с интервалом в месяц в течении полугода, для контроля роста и развития. Выделение геномной ДНК производителей проводилась фенольным методом в лаборатории. Были подобраны праймеры к дублированному гену BMP-2 (костный морфогенетический белок 2) на 4 и 24 хромосоме.

Проведение ПЦР

Дизайн ПЦР праймеров, специфичных для определенных участков генов BMP-2 и LCORL, проводили по онлайн программе Primer 3 Plus (см. таблицы 2  и 3). Последовательности нуклеотидов указанных генов (один экзон и два интрона) были найдены в литературе  и взяты из доступной базы данных GenBank и NCBI.

Амплификацию методом ПЦР на амплификаторе ThermalCycler T100 (Bio-Rad, США) в следующем режиме: 95°С– 4 мин., 40 циклов 95°С – 20 сек., 60°С – 20 сек., 72°С - 20 сек. и финальная элонгация 72°С – 4 минуты. ПЦР-продукт проверяли на электрофорезе в 2,0% агарозном геле в буфере 0,5xTBE.

В дальнейшей работе, полученные амплификаты будут секвенироваться на предмет выявления однонуклеотидных полиморфизмов в генах BMP-2 и LCORL.

Все изученные размерно-весовые характеристики производителей были сведены в таблицы (см. таблицы 4 и 5).  Промеры потомков измеряли каждый месяц в течение полугода, полные данные содержатся в базе данных в Excel. Наблюдалась выраженная вариация по всем признакам, что является характерным как для индивидуальных особей-производителей, так и для растущего потомства радужной форели.

Выборочные данные по размерно-весовым характеристикам, касающиеся первых четырех пар производителей, в качестве примера, представлены в таблице 6. Это данные, включающие последнюю бонитировку от 10.09.2021 (см. таблицу 6).

Средние размерно-весовые  показатели по  50-ти потомкам от каждой из восьми  пар производителей рассчитывали по данным бонитировки. Бонитировка потомства проводилась ежемесячно  в течение полугода.

Таким образом, были отобраны пары производителей форели ропшинская золотая и сняты их размерно-весовые показатели.  От восьми пар производителей было получено потомство, от каждой семьи брали по 50 особей, которых бонитировали ежемесячно в течении полугода и на этой основе создана соответствующая база данных. Подобраны праймеры для амплификации участков гена BMP-2.