THE USE OF LACTOBACILLUS CASEI BASED PROBIOTICS IN BEEKEEPING

ПРИМЕНЕНИЕ ПРОБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ LACTOBACILLUS CASEI В ПЧЕЛОВОДСТВЕ

Научная статья

Заболоцкая Т.В.¹, Штауфен А.В.², Миронова Е.Е.^3, *

^{1, 3} Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина, Москва, Россия;

² ИП Галтвин Э. А., Москва, Россия

* Корреспондирующий автор (catherinamirr[at]mail.ru)

Аннотация

Одним из наиболее перспективных биологических препаратов для борьбы с инфекциями пчел и сохранения пчелосемейств являются пробиотики. Однако, необходимо понимать, что некоторые пробиотические (бациллярные) штаммы оказывают антагонистическое действие в отношении патогенных микроорганизмов в основном за счет выработки антибиотических веществ, что может также привести к ограничению их применения и значительному сужению спектра предлагаемых для применения в пчеловодстве пробиотиков. В статье представлены результаты исследований по изучению антагонистического спектра и активности штаммов L. casei. В ходе работы выявлено положительное влияние и проведена оценка действия L. casei на организм пчел.

Ключевые слова: пробиотики в пчеловодстве, антагонистическая активность, общее состояние кишечника пчел.

THE USE OF LACTOBACILLUS CASEI BASED PROBIOTICS IN BEEKEEPING

Research article

Zabolotskaya T.V.¹, Shtaufen A.V.², Mironova E.E.^3, *

^{1, 3} Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology named K.I. Skryabin, Moscow, Russia;

² Sole proprietor (Individualny predprinimatel) Galtvin E. A. , Moscow, Russia

* Corresponding author (catherinamirr[at]mail.ru)

Abstract

Probiotics are one of the most promising biological drugs for combating bee infections and preserving bee colonies. However, it is necessary to understand that some probiotic (bacillary) strains have an antagonistic effect against pathogenic microorganisms mainly due to the production of antibiotic substances, which can also lead to a restriction of their use and a significant narrowing of the spectrum of probiotics offered for use in beekeeping. The article presents the results of research on the antagonistic spectrum and activity of L. casei strains. The study demonstrates a positive effect and conducts a study of the effect of L. casei on the body of bees.

Keywords: probiotics in beekeeping, antagonistic activity, the general state of the intestines of bees.

Введение

Пчеловодство является весьма специфической отраслью сельского хозяйства, на котором негативно сказываются современные принципы интенсификации. Сложная экологическая ситуация ведет к массовым болезням и гибели пчелосемейств. Так, в 2015 году на территориях США погибло около 40% пчелиных семейств пасек, в Европейских странах их количество сократилось на 12%. В 2019 году в 25 регионах России от использования агропромышленных химикатов была зафиксирована гибель 37,8 тысяч пчелосемей. Медоносные пчелы являются основными опылителями цветковых растений, в том числе многих сельскохозяйственных культур. Во время кормления они могут подвергаться негативному воздействию различных ксенобиотиков. Гибель пчёл влияет на глобальную продовольственную безопасность и может привести к исчезновению около 20 тысяч видов цветковых растений и подрыву основ наземных экосистем. Массовое несоблюдение правил и норм применения агрохимикатов приводит к снижению защитных функций иммунной системы пчел и, как следствие широкому распространению таких болезней как гафниоз, парагнилец, американский и европейский гнилец и др. Использование антибиотиков для лечения инфекций пчел имеют достаточные ограничения с учетом того, что большинство продукции пчеловодства относится к пищевым продуктам. Поэтому большинство ученых обращают свое внимание по вопросам борьбы с инфекционными болезнями пчел на такие биологические препараты как пробиотики [1, С. 32-34], [2].

Ценность этих препаратов в том, что они безопасны для окружающей среды, животных, птиц, насекомых и человека. Также они способствуют развитию полезной микрофлоры не только в желудочно-кишечном тракте животных, птиц, насекомых, но и в почве. Пробиотики характеризуются нулевым сроком ожидания, то есть реализацию товарной продукции можно осуществлять непосредственно после применения [3].

Представителями индигенной (бактерии, которые являются постоянными обитателями кишечника животных и человека) микрофлоры желудочно-кишечного тракта пчел, являются Lactobacillus, обладающие пробиотическими свойствами.

Lactobacillus – это грамположительные, аэробные или микроаэрофильные, палочковидные, не спорообразующие бактерии. Традиционно лактобациллы рассматривают как представителей одной из самых разнообразных по своему видовому составу и свойствам группы молочнокислых бактерий, объединяющей микроорганизмы, характерной чертой которых является образование молочной кислоты в качестве основного продукта брожения.

Пробиотики улучшают переваримость пищи, имеют выраженные ферментативные и протеолитические свойства. Продуцируют такие пищеварительные ферменты, как амилаза, липаза, пектиназа, протеаза, эндоглюконаза. В кишечнике пробиотические микроорганизмы действуют симбиотически и модулируют иммунитет. Такие пробиотики, как лактобактерии, могут активизировать процессы жизнедеятельности бифидобактерий [4, C. 55-56].

Потенциально кишечные бактерии медоносной пчелы играют роль в нейтрализации пищевых токсинов, биосинтезе необходимых питательных веществ или переваривании компонентов пищи, включая ферментацию сложных углеводов и сахаров, неперевариваемых самой пчелой.

Методы и принципы исследования

Исследования проводились на базе кафедры иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «МГАВМиБ - МВА им. К.И. Скрябина».

Оценку качественных и количественных показателей микрофлоры пищеварительного тракта пчел осуществляли, используя бактериологические методы: подсчет микробных клеток на дифференциально-диагностических средах (Эндо, маннит-солевой агар, лактобакагар, среда Клиглера и МПА).

В ходе проведения исследований использовали:

• бактериологические методы выделения и идентификации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [5], [6], [7];
• изучение антагонистической активности пробиотических штаммов;
• оценка состояния кишечного тракта пчел по балльному методу, предложенному Шагун Л.А.;
• метод статистической обработки данных с использованием стандартной базы.

Для проведения исследования живых пчел усыпляли в морозильной камере. Отбирали по 10 пчел каждой исследуемой семьи и oтпрепаровывали кишечник, состояние которого сразу же оценивали. Затем тщательно гoмогенизировали и готовили 3х-кратное разведений на изотоническом растворе хлорида натрий (физиологический раствор). Из полученных разведений, с помощью градуированной пипетки на поверхность селективных питательных сред делали посевы. Через 24-72 ч инкубации при 37˚С осуществляли учет выросших колоний.

Идентификацию выделенных бактерий осуществляли по морфологическим, культуральным, биохимическим и тинкторильным свойствам.

Оценку антибактериальных свойств проводили с помощью посева патогенных микроорганизмов с дисками, содержащих культуральную жидкость пробиотических штаммов. Для этого диски фильтровальной бумаги опускали в культуральную жидкость и выкладывали на «газон» патогенных микроорганизмов.

Основные результаты

Изучение микробиома пчел взятых с пасек районов Московской области (Зарайский, Раменский, Сергиево-Посадский) выявил преимущественное заселение кишечника пчел такими микроорганизмами как: E. coli, Proteus, Citrobacter, Klebsiella и Hafnia.

Исследования антагонистической активности штаммов L. casei и ее фугатов (культуральной жидкости) в отношении чистых культур выделенных патогенов показали их достаточную активность, результаты представлены в таблице 1.

 

Таблица 1 – Антагонистическая активность культуральной жидкости Lactobacillus casei в отношении патогенных микроорганизмов

№ п\п	Патогенный микроорганизм	Величина зоны задержки роста (см)	Активность
1	E.coli	1,8	средняя
2	Proteus	0,7	низкая
3	Citrobacter	1,5	средняя
4	Klebsiella	1,5	средняя
5	Hafnia	1,4	средняя

 

Результаты изучения антагонистической активности культуральной жидкости L. casei показывают ее наличие в отношении практически всех выделенных патогенов, зона задержки роста патогенных микроорганизмов в среднем составляла 1,5 сантиметров, что соответствует средней активности.

Оценка состояния кишечника пчел проводилась двукратно: первоначально оценивали по 10 насекомых с каждой пасеки, последующая оценка осуществлялась после дачи пробиотика на основе L. casei путем добавления в сироп в концентрации 10⁹ микробных клеток, ежедневно, один раз в день, в течение 2-х недель результаты представлены в таблице 2, 3.

 

Таблица 2 – Оценка состояния кишечного тракта пчел на основе балльного метода (по Шагун)

№ п\п	Серия	Зарайский район	Раменский район	Сергиево-Посадский район
1	опыт	3,5	2,9	2,9
2	контроль	2,9	2,4	2,3

 

Таблица 3 – Статистические данные по оценке кишечного тракта пчел

Район	Опыт Зарайский район	Контроль Зарайский район	Опыт Раменский район	Контроль Раменский район	Опыт Сергиево-Посадский район	Контроль Сергиево-Посадский район
Стандартная ошибка	0,115	0,147	0,154	0,163	0,153	0,153
Значение степени достоверности	0,0399092		0,0876356		0,0516397
Значение степени корреляции	-0,1203859		0,4285714		0,4206926

 

Полученные в ходе проведенных исследований результаты указывают на значительное улучшение состояния кишечника пчел даже после однократного курса применения пробиотика, и в среднем составило 0,5 балла.

Полученные положительные результаты применения пробиотиков на основе L. casei подтверждаются и другими авторами, указывающими, что лактобактерии способны противодействовать токсичному влиянию инсектицидов, являющихся весьма губительными для пчел [8, С. 4-7]. При проведении подкормки пробиотическим препаратом на основе лактобактерий, у пчел повышается устойчивость к токсинам и значительно быстрее происходит восстановление после негативного влияния пестицидов [9, С. 142-143].

Пробиотические препараты способны подавлять рост и размножение других микроорганизмов, способных вызывать инфекции у медоносных пчел, за счет входящих в препарат бактерий, обладающих антифунгальными и антибактериальными свойствами [10, С. 4]. Пробиотик применяется в пчеловодстве путем внесения его в подкормку или же опрыскиванием [11, С. 376-377]. Таким образом, пробиотические препараты сохраняют здоровую микрофлору кишечника медоносной пчелы, тем самым влияя на положительную динамику физиологической активности и жизнеспособность пчелиных семей [12, С. 160-161].

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Домацкая Т. Ф. Возможность применения пробиотиков для лечения аскосфероза / Т. Ф. Домацкая // Пчеловодство. – 2017г. - №1. – С. 32-34;
2. Пробиотики. Симпозиум №10 / Донецкий национальный медицинский университет // 2017г.;
3. Министерство здравоохранения Российской Федерации. Общая фармакопейная статья 1.7.1.0008.15. Пробиотики. – 2018 г. – С. 13;
4. Глушанова Н. А. Биологические свойства лактобацилл / Н. А. Глушанова // Бюллетень сибирской медицины. – 2003 г. - №4. – С. 50-58.
5. ГОСТ 10444.12-88 Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов;
6. ГОСТ 31928-2013 Средства лекарственные для ветеринарного применения пробиотические. Методы определения пробиотических микроорганизмов;
7. Министерство здравоохранения Российской Федерации. Общая фармакопейная статья 7.2.0008.15 Определение концентрации микробных клеток. – 2018г. – С. 13.;
8. Аликин Ю. С. Биологические вещества в профилактике и лечении сельскохозяйственных животных / Ю. С. Аликин, Ю. Г. Юшков, В. Д. Чемитов // БИО. - 2002г. - №3. С.4-7;
9. Новик Г. И. Латобациллы: биотехнологический потенциал и проблемы идентификации. / Г.И. Новик, А. В. Сидоренко // Проблемы здоровья и экологии. – 2007 г.-№1. - С. 141-149.
10. Ершова И. Б. Актуальные вопросы совместного применения антибактериальных препаратов и пробиотиков / И. Б. Ершова, А. А. Мочалова, Т. Ф. Осипова и др. // Инфектология. - 2015г. - №3 (8);
11. Бармина И. Э. Стимулирующие подкормки для пчелиных семей с добавлением комплексных аминокислотных и пробиотических препаратов / И. Э. Бармина, А. Г. Маннапов, Г. В. Карпова // Вестник ОГУ. -2011г.-№12 (131). - С.376-377.
12. Сердюченко И.В. количественная оценка микрофлоры пищеварительного тракта пчел до и после зимовки / И.В. Сердюченко // Молодой ученый. - 2017. - №2. - С. 157-166.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Domatskaya T. F. Vozmozhnost' primenenija probiotikov dlja lechenija askosferoza [The possibility of using probiotics for the treatment of ascospherosis] / T. F. Domatskaya // Pchelovodstvo [Beekeeping]. - 2017. - No. 1 – pp. 32-34 [in Russian]
2. Simpozium №10 [Probiotics. Symposium No. 10] / Donetsk National Medical University // 2017 [in Russian]
3. Ministerstvo zdravookhranenija Rossijjskojj Federacii. Obshhaja farmakopejjnaja stat'ja 1.7.1.0008.15. Probiotiki [Ministry of Health of the Russian Federation. General Pharmacopoeia article 1.7.1.0008.15. Probiotics]. - 2018 - p. 13 [in Russian]
4. Glushanova N. A. Biologicheskie svojjstva laktobacill [Biological properties of lactobacilli] / N. A. Glushanova // Bjulleten'Vstavit' sibirskojj mediciny [Bulletin of Siberian Medicine]. - 2003-No. 4. - pp. 50-58 [in Russian]
5. GOST 10444.12-88 Produkty pishhevye. Metod opredelenija drozhzhejj i plesnevykh gribov [Food products. Method for determining yeast and mold fungi] [in Russian]
6. GOST 31928-2013 Sredstva lekarstvennye dlja veterinarnogo primenenija probioticheskie. Metody opredelenija probioticheskikh mikroorganizmov [Medicinal products for veterinary use probiotic. Methods for the determination of probiotic microorganisms] [in Russian]
7. Ministerstvo zdravookhranenija Rossijjskojj Federacii. Obshhaja farmakopejjnaja stat'ja 1.7.2.0008.15 Opredelenie koncentracii mikrobnykh kletok [Ministry of Health of the Russian Federation. General Pharmacopoeia article 1.7.2.0008.15 Determination of the concentration of microbial cells]. - 2018. - p. 13 [in Russian]
8. Alikin Yu. S. Biologicheskie veshhestva v profilaktike i lechenii sel'skokhozjajjstvennykh zhivotnykh [Biological substances in the prevention and treatment of farm animals] / Yu. S. Alikin, Yu. G. Yushkov, V. D. Chemitov // BIO. - 2002. - No. 3, pp. 4-7 [in Russian]
9. Novik G. I. Latobacilly: biotekhnologicheskijj potencial i problemy identifikacii [Lactobacilli: biotechnological potential and identification problems] / G. I. Novik, A. V. Sidorenko // Problemy zdorov'ja i ehkologii [Health and environmental problems]. - 2007-No. 1. - pp. 141-149 [in Russian]
10. Yershova I. B. Aktual'nye voprosy sovmestnogo primenenija antibakterial'nykh preparatov i probiotikov [Topical issues of the joint use of antibacterial drugs and probiotics] / I. B. Yershova, A. A. Mochalova, T. F. Osipova, et al. // Infektologiya [Infectology]. - 2015 - No. 3 (8) [in Russian]
11. Barmina I. E. Stimulirujushhie podkormki dlja pchelinykh semejj s dobavleniem kompleksnykh aminokislotnykh i probioticheskikh preparatov [Stimulating top dressing for bee colonies with the addition of complex amino acid and probiotic preparations] / I. E. Barmina, A. G. Mannapov, G. V. Karpova // Vestnik OGU [Bulletin of the OSU]. - 2011. - No. 12 (131). - pp. 376-377 [in Russian]
12. Serdyuchenko I. V. kolichestvennaja ocenka mikroflory pishhevaritel'nogo trakta pchel do i posle zimovki [A quantitative assessment of the microflora of the digestive tract of bees before and after wintering] / I. V. Serdyuchenko // Molodojj uchenyjj [Young scientist]. - 2017. - No. 2. - pp. 157-166 [in Russian]