DEVELOPMENT OF A MODEL OF UV-INDUCED MELANOMA
DEVELOPMENT OF A MODEL OF UV-INDUCED MELANOMA
Abstract
Dermal melanocytes and fibroblasts from human skin, in an in vitro model system, represent a test system for studying UV-induced genetic instability and the carcinogenic potential of melanoma. Driver mutations in the NRAS, BRAFV600E and CDKN2A genes play a key role in the early stages of tumour transformation in skin lesions, both malignant and benign (naevi). Analysis of the effects of UV-C using co-culture, as opposed to monocultures, showed that, under in vitro conditions, co-culture facilitates the development of a complex model of histomorphological correspondence between the spatial and functional similarities of tissue structures, within which paracrine mechanisms of cytokine communication similar to those observed in vivo are established. The aim of the study is to analyse the co-culture of human dermal melanocytes and skin fibroblasts in an in vitro model following UV-C exposure, from the perspective of morphogenetic reactive changes in the context of studying the early stages of melanoma oncogenesis. The cell line was cultured in accordance with Freshney's recommendations. UV-C irradiation was simulated with exposure times of 30 and 40 seconds. This was followed by an evaluation of morphological parameters, proliferative potential, cell death pathways, cell cycle analysis and the detection of mutations in the BRAF, NRAS and CDKN2A genes using allele-specific real-time PCR (AS-qPCR) with hybridisation-fluorescence detection.
Analysis of the studied indicators and 3D models of UV-induced melanoma in an in vitro system using co-cultures of dermal melanocytes and fibroblasts, with a focus on the early stages of melanoma oncogenesis, identified dose-dependent changes, such as: a decrease in cell number and the proliferation index by day 14 (most pronounced in the CulUV2 group), and an increase in the proportion of cells in the S phase (CulUV1) and G2/M phase (CulUV2). In the CulUV1 group, an increase in the number of cells at the late stage of apoptosis was observed. No significant changes were found in the number of cells dying via necroptosis. In both experimental groups, a reduction in the number of viable cells was observed. Furthermore, in both groups (CulUV1 and CulUV2), no mutations were detected in the BRAF, NRAS and CDKN2A genes, which is consistent with the literature data on the low accumulation of mutations in cell culture.
1. Введение
Кожа — полифункциональный пограничный многотканевый орган, в процессе онтогенеза закладывается из двух эмбриональных зачатков — нейрогенного (меланоциты) и мезенхимного (фибробласты). В связи с пограничным положением испытывает воздействие различных факторов внешней среды, ключевым из которых является ультрафиолетовое облучение (УФО) , , , . Длинноволновое (УФ-А, 320–400 нм) и средневолновое (УФ-В, 280–320 нм) излучения в естественных условиях достигают поверхности Земли, постоянно воздействуют на живые организмы, на сегодняшний день уже достаточно хорошо и всесторонне изучены. В частности, известно, что УФ-А активирует пролиферацию, регенерацию, клеточный иммунитет, ускоряет гидролиз коллагена . УФ-В инициирует синтез витамина D и оказывает иммуномодулирующее и десенсибилизирующее действие , ; оба спектра являются главными факторами развития спорадической формы меланомы кожи, вызывая мутации генов супрессоров опухоли и трансформацию меланоцитов .
В отличие от УФ-А и УФ-В, коротковолновое излучение УФ-С в естественных условиях поглощается озоновым слоем. Тем не менее, массовое применение искусственных источников УФ-С (бактерицидных ламп) для стерилизации воздуха, воды и поверхностей требует тщательного изучения его мутагенности. Более того, известно, что фотоны УФ-С, как более высокоэнергетического излучения, оказывают наиболее выраженное мутагенное действие, так как этот спектр лучей совпадает со спектром поглощения нуклеиновых кислот, поэтому УФ-С служит идеальным инструментом для изучения механизмов повреждения в структуре ДНК, последующей репарации, активации УФО-индуцированного апоптоза, что критически важно для изучения механизмов онкогенеза , , , . Так, в частности, формирование CPD (циклобутановые пиримидиновые димеры Cyclobutane Pyrimidine Dimers) при воздействии УФ-С примерно в 100 раз эффективнее, чем при воздействии УФ-В, кроме этого УФ-С и УФ-В определяют оба типа повреждения в структуре ДНК (CPD и 6–4PP/pyrimidine 6-4 pyrimidone photoproducts), тогда как УФ-А только CPD , . Следовательно, УФ-С и УФ-В оба являются высокомутагенными. Хроническое облучение УФ-С индуцирует развитие устойчивой резистентности клеток меланомы к противоопухолевым препаратам .
УФО вызывает развитие меланомы как через малигнизацию невусов, так и через трансформацию меланоцитов кожи de novo , . Меланома in situ чаще локализуется на участках кожи с хронической инсоляцией — CSD (chronically sun damaged) . Основной сигнальный путь трансформации меланоцитов — MAPK, за счет активации генов RAS и RAF . NRAS является одним из наиболее часто поражаемых генов членов семейства RAS. Наиболее распространенным сайтом мутации является кодон 61 в экзоне 2 (C181A (Q61K) и A182G (Q61R)). Ген BRAF играет ключевую роль в сигнальном пути MAPK, так мутация BRAFV600Е является хорошо известной «драйвер» мутацией (40–60% случаев меланом) . Второй сигнальный путь, который активируется при меланоме — PI3K-AKT-mTOR. УФ-индуцированные мутации часто обнаруживаются в гене CDKN2A (кодирует белки-супрессоры опухолей p16 и p14ARF), первым геном с доказанным влиянием на возникновение наследственной меланомы .
Анализ влияния УФО с использованием кокультуры меланоцитов и фибробластов на генетическую нестабильность и канцерогенез меланомы в системе in vitro снимает этические и клинические ограничения, в отличие от монокультур, более физиологичен, за счет установления паракринных межклеточных взаимодействий , , . Так, фибробласты коммуницируют с меланоцитами посредством межклеточных контактов и секрецией цитокинов (SCF), белков (DKK1, sFRP, Sema7a, CCN, FAP-α) и факторов роста (KGF, HGF, bFGF, NT-3, NRG-1, TGF-β), модулируя сигнальные каскады MAPK/ERK, cAMP/PKA, Wnt/β-катенин, PI3K/Akt. Эти факторы влияют на рост, пигментацию, миграцию и адгезию меланоцитов. Также отмечено, что под воздействием УФО происходит продукция кератиноцитами цитокинов и факторов роста, которые стимулируют развитие меланомы, а комбинация MITF, SOX10 и PAX3 преобразует фибробласты мыши и человека в функциональные меланоциты . Меланоциты эпидермиса и волосяного фолликула образуют биологически разные популяции, взаимодействуя с кератиноцитами и фибробластами паракринно и контактно . Фибробласты регулируют рост и развитие меланоцитов через SCF и NRG1, включая влияние на процесс меланогенеза. Соотношение меланоцитов и кератиноцитов — 1:5, которые формируют эпидермально-меланиновую единицу.
В связи с этим целью нашей работы является анализ морфогенетических реактивных изменений в аспекте изучения ранних этапов онкогенеза меланомы на модельной системе кокультуры дермальных меланоцитов и фибробластов in vitro кожи человека после УФО.
2. Методы и принципы исследования
Для получения 3D-кокультуры клеток кожи использовали экспланты кожного лоскута (1,0×5,0 см) из области груди (ареола), взятые с информированного согласия пациента при плановой операции. Материал был получен от трех пациентов в возрасте 38-40 лет. Каждый эксперимент проводили в 8 повторностях (n=8), что обеспечило воспроизводимость полученных результатов. Ферментативную дезагрегацию ткани проводили с помощью трипсина по стандартному протоколу . Для культивировали использована питательная среда, состоящая из RPMI-1640, 10% сыворотки эмбрионов телят и 100 мкг/мл гентамицина (ПанЭко, Россия). Инкубировали при 5% СО2 и +37°С (СО2-инкубатор CB-53, BINDER GmbH, Германия). Смену среды проводили каждые 3 суток. Полноценный монослой в первичной культуре формировался на 20–30-е сутки. Для субкультивирования клетки переводили в суспензию трипсин-ЭДТА (ПанЭко, Россия) по методике Фрешни и расселяли в концентрации 200 тыс./мл.
Культивирование кокультуры проводили путем посева на носитель/систему «Transwell» (Corning, США) — пористые мембранные вставки из тетрафторэтилена (ПТФЭ) с коллагеновым покрытием, которые используют для совместного культивирования нескольких клеточных линий в трехмерном пространстве- 3D (подобие in vivo). Размер пор варьируется от 0,4 до 8 мкм, толщина составляет 10–30 мкм, а пористость — 10–15% .
Идентификацию/подтверждение принадлежности клеток к меланоцитарной линии дифференцировки и к линии клеток фибробластического дифферона проводили с использованием кластеров дифференцировки (CD) в культуре (иммунофенотипирование) методом проточной цитофлуорииметрии на проточном цитофлуориметрие CyFlowSpace (Partec, Германия) с лазером 488 нм и фильтром 650 нм. , . Так, в частности, для подтверждения клеток меланоцитарной линии эпидермальных меланоцитов использовали СD117 (c-Kit, рецепторная тирозинкиназа) , , , . Идентификацию клеточной популяции фибробластов проводили с использованием CD90 (Thy-1, гликопротеин клеточной поверхности) , .
Анализ программированной клеточной гибели (апоптоз, некроптоз) и клеточного цикла проводили на проточном цитофлуориметрие CyFlowSpace (Partec, Германия), лазер 488 нм и фильтр 650 нм. Клетки снимали с Трипсин-ЭДТА, отмывали PBS, центрифугировали (1500 об/мин, 5 мин). Суспензию фильтровали через 100 мкм нейлоновый фильтр. Работу проводили с использованием набора Annexin V PE/7AAD (BD Bioscientices, США) согласно инструкции производителя: Аннексин V-/7AAD- — интактные клетки, Аннекснин V+/7AAD- — ранний апоптоз, Аннекснин V+/7AAD+ — поздний апоптоз, Аннекснин V-/7AAD+ — некроптоз. Для анализа клеточного цикла клетки фиксировали в 70% этаноле, окрашивали пропидий йодидом, оценивали фазы G0/G1, S и G2/M.
В процессе работы с помощью гейтирования выделялись клетки в определённом диапазоне (по SSC/FSC) для исключения клеточного дебриса. Алгоритм гейтирования: дискриминация дуплетов (Singlets) за счет построения графика соотношения площади сигнала (FSC-A) к высоте (FSC-H). Клетки, идущие поодиночке, образуют прямую диагональ вокруг которой создают первый гейт. Далее исключают слипшиеся клетки, дебрис и мертвых клеток используя параметры прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. Дебрис имеет очень низкий FSC. Для точной отсечки мертвых клеток используют витальные красители (в частности, 7-AAD), задав гейт на негативную по флуоресценции популяцию, далее выделяли специфические популяции. Гейтируемые регионы устанавливали на точечных диаграммах распределения событий в координатах 100 FSC/SSC. Полученные гистограммы и точечные графики (дот-плоты) анализировали с оценкой абсолютного числа, процентного соотношения популяций и выявления аномальных (аберрантных) клеток.
Исследования 3D модели УФ-индуцированной меланомы в системе in vitro проводили на кокультурах 3-го пассажа (8-й день). Перед облучением ростовую среду заменяли на DPBS, после облучения — на свежую питательную среду. Источник УФО-С — ртутная лампа низкого давления (36 Вт, Thermo Scientific, США) с максимумом излучения в УФ (253,7 нм). УФО проводили 30 и 40 секунд (экспозиции подобраны ранее); мощность составила 20 Дж/см2. Сформированы 3 группы кокультур:
- Cul — контроль (без облучения);
- CulUV1 — облучение 30 секунд;
- CulUV2 — облучение 40 секунд (рис. 1).
Дизайн эксперимента
Подсчет количества жизнеспособных и погибших клеток проводили на автоматическом счетчике TC-20 (BIO-RAD, США) с окраской трипановым синим (3 повтора на пробу). Индекс пролиферации (ИП) = численность клеток после культивирования / исходная численность. Пролиферативный потенциал оценивали по динамике жизнеспособных клеток.
Флуоресцентная микроскопия – прижизненное окрашивание Hoechst 33258 (Sigma, США; возбуждение 352 нм, эмиссия 461 нм) на микроскопе Axio Vert. A1 FL.
Выявление мутаций BRAF, NRAS и CDKN2A проводили методом аллель-специфической real-time ПЦР (AS-qPCR) с гибридизионно-флуоресцентной детекцией на амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad, США). In silico дизайн высокоспецифичных конструкций олигонуклеотидных праймеров (табл. 1) к точкам мутаций анализируемых генов проводили с использованием программного обеспечения Unipro UGENE v1.29.0 и Mega 10 — Molecular Evolutionary Genetics Analysis (http://www.megasoftware.net), BLAST — Basic Local Alignment Search Tool (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Использованные в работе олигонуклеотидные праймеры
Ген | Мутация | Праймеры | Длина продукта, п.н. |
BRAF | p.V600E (c.1799T>A) | F.: ctagtaactcagcagcatctcagg R.: gaaagcatctcacctcactcaacac | 434 |
NRAS | p.Q61H (c.183R>Y) p.Q61R (c.182A>G) p.Q61L (c.182A>T) p.Q61K (c.181C>A) | F.: aagctctatcttccctagtgtgg R.: gacaaaccagataggcagaaatgg | 409 |
CDKN2A | p.P114L (c.341C>T) p.W110* (c.330G>A) p.W110* (c.329G>A) p.R80* (c.238C>T) p.R58* (c.172C>T) | F.: tgctggaaaatgaatgctctgagc R.: atgtaggggtacttagcacactgg | 403 |
p.Q50* (c.148C>T) | F.: ctcatctctcttcttggcttcc R.: agcaccggaggaagaaagaggag | 466 |
Статистическую обработку проводили в программах Excel 2010 и Prism 8.0.1 (Graphpad, США). Нормальность распределения проверяли критерием Шапиро–Уилка. Для каждой выборки рассчитывали среднее и стандартное отклонение. Достоверность различий между группами оценивали по t-критерию Стьюдента; критический уровень значимости p<0,05.
3. Основные результаты и обсуждение
Кокультура дермальных меланоцитов и фибробластов 3-го пассажа представлена клетками кожи двух дифферонов с разной степенью дифференцировки. Прикрепленные клетки веретеновидной удлиненной (активные фибробласты) или распластанной звездчатой с отростками (меланоциты) формы (рис. 2), с четким контуром и плотным ядром. Фибробласты веретеновидные, с отростками первого и второго порядка, ориентированы параллельно или волнообразно вокруг центра колонии. В слабо базофильной цитоплазме выделяются эндоплазма (нитевидные структуры, гранулы) и эктоплазма (микрофибриллы). Ядро овальное, базофильное, с 2–4 ядрышками, что указывает на метаболическую активность фибробластов (рис. 2В). Меланоциты полигональной, трехгранной или звездчатой формы с 3-5 отростками и плотным ядром (рис. 2Д).
За первые 7 дней культивирования (до УФО) прирост клеточной массы был синхронным. Индекс пролиферации (ИП) составил в группах Cul, CulUV1 и CulUV2 — 3,07; 3,25 и 2,89, соответственно; пролиферативный потенциал (ПП) — 94%, 91% и 90%, соответственно. Межгрупповых статистически значимых различий по общему количеству клеток (ОКК) и количеству жизнеспособных клеток (КЖК) не выявлено.
Кокультура фибробластов и дермальных меланоцитов. Световая микроскопия (витальная культура): А – 7 сутки культивирования. Окраска ГЭ: Б – 7 сутки культивирования, В – 8 сутки культивирования, Г, Д – 16 сутки культивирования
стрелки черного цвета – меланоциты, синего цвета – фибробласты. 1 – звездчатая форма; 2 – полигональная форма; 3 – трехгранная форма
Кокультура CulUV2 (УФО 40 с): через 24 часа после УФО изменения со стороны морфологии клеток в данной группе более выраженные: грубозернистая цитоплазма, истончение отростков вплоть до полной редукции (рис. 3Б). Отмечается мозаичность реактивных изменений: присутствуют как интактные клетки, так и клетки с УФО-индуцируемым некроптозом. Согласно концепции неклеточной автономной регуляции, фенотипы могут определяться связью «лиганд-рецептор» между соседними клетками. Это имеет место в некоторых формах клеточной конкуренции, где клетки чувствуют более низкую приспособленность своих соседей через взаимодействия Slit-Robo, Spaetzle-Toll или Sas-PTP10D, но и зависят от прямого контакта с неповрежденными соседними клетками , , . Поврежденные клетки способствуют прогрессированию апоптоза и удалению сильно поврежденных клеток, одновременно снижая их транскрипционный ответ на УФО, включая реакцию на окислительный стресс и другие механизмы. Такая регуляция на уровне популяции может представлять собой общий механизм, посредством которого клеточные сообщества способствуют удалению сильно поврежденных клеток .
В группах CulUV1 и CulUV2 показатели ОКК и КЖК статистически не различаются (p>0,05). ИП увеличен по сравнению с контролем (1,28): в CulUV1 — 1,35, в CulUV2 — 1,42. ПП снижается относительно контроля (94%): в CulUV1 — 83%, в CulUV2 — 70%, как показатель дозозависимого снижения числа жизнеспособных клеток.
Кокультура фибробластов и дермальных меланоцитов: А –CulUV1, Б – CulUV2
увеличение ок. 10 х об. 20
На фоне дозозависимого снижения ОКК отмечено изменение показателей клеточного цикла (рис. 4). Так, на стадии G0/G1: контроль — 88,1%, CulUV1 — 83,8, CulUV2 — 80,4%. На S-стадии: контроль — 4,4%, CulUV1 — 8,5%, CulUV2 — 4,7%. На стадии G2/M: в CulUV2 (14,9%) — в два раза выше, чем в контроле (7,5%) и CulUV1 (7,7%). Это отражает активацию чек-пойнт системы контроля клеточного цикла на границе G2 и М-стадии клеточного цикла и УФ-индуцируемого апоптоза .
Проточная цитофлуориметрия. Клеточный цикл кокультуры дермальных меланоцитов и фибробластов в группах Cul (А), CulUV1 (Б) и CulUV2 (В). Окраска PI
УФО — индуктор апоптоза в культивируемых клетках, является адекватной реакцией на повреждение УФО, обусловленной как уже отмечалось выше повреждением ДНК и ядра и митохондрий, нарушением механизмов репарации ДНК (в первую очередь фотореактивация, эксцизионная и пострепликативная), дисфункцией митохондрий, АФК и активацией каспаз на фоне гипоксии , , . Так, в частности, УФО приводит к нарушению функции митохондрий, главным образом, за счет повреждения мтДНК и, как следствие, определяет чрезмерное образование АФК, что приводит к усилению окислительного стресса в клетках, вызывает нарушение мембранного потенциала митохондрий и баланс ионов кальция. В свою очередь, избыток АФК приводит к окислению липидов и белков митохондрий с нарушением энергетического метаболизма , , . Морфологические признаки апоптоза определяются активностью эфекторных каспаз 3 и 7, которые определяют фрагментацию ДНК, апоптозные изменения и потерю жизнеспособности клетки, являясь ключевым медиатором нарушения митохондриального потенциала и высвобождения AIF . Следствием этого является коллапс ядра: сначала пикноз (за счет активации трансглютаминазы), затем поэтапная упорядоченная фрагментация ДНК . Нарушается асимметрия фосфолипидов мембраны (экспозиция фосфатидилсерина и других продуктов), что способствует фагоцитозу апоптических клеток макрофагами. Финальная фаза — образование «апоптотических телец» — блеббинг.
Проточная цитофлуориметрия. Кокультура фибробластов и дермальных меланоцитов. Реализация ПКГ в группе Cul (А) и через 24 часа после облучения в течение 30 сек – группа CulUV1 (Б). Окраска 7AAD, Аннексин V
Q1 – ранний апоптоз, Q2 – поздний апоптоз, Q3 – интактные клетки, Q4 – некроптоз
В группах CulUV1 и CulUV2 мутаций генов BRAF, NRAS и CDKN2A не выявлено, что согласуется с литературными данными о низком накоплении мутаций в культуре .
4. Заключение
Таким образом, проведенные исследования 3D модели УФ-индуцированной меланомы в системе in vitro на кокультурах дермальных меланоцитов и фибробластах позволили выявить дозозависимые изменения: снижение числа клеток и индекса пролиферации к 14-м суткам (максимально в группе CulUV2), увеличение доли клеток в S-фазе (CulUV1) и G2/M-фазе (CulUV2). В группе CulUV1 выявлено увеличение числа клеток на стадии позднего апоптоза. Значимых изменений числа клеток, погибающих по пути некроптоза не выявлено. В обеих экспериментальных группах отмечается уменьшение числа жизнеспособных клеток. А также в обеих группах (CulUV1) и (CulUV2) не выявлено мутаций генов BRAF, NRAS и CDKN2A, что согласуется с литературными данными о низком накоплении мутаций в клеточной культуре.