POLIMORPHISMS IN GENES OF RECEPTORS OF INNATE IMMUNITY ASSOCIATED WITH CARDIOVASCULAR DISEASE

Хуторная М.В.¹, Понасенко А.В.², Головкин А.С.³

¹Младший научный сотрудник лаборатории геномной медицины; ²ведущий научный сотрудник, исполняющий обязанности заведующего лабораторией геномной медицины; ³кандидат медицинских наук, заведующий отделом экспериментальной и клинической кардиологии ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечно - сосудистых заболеваний» СО РАМН, Россия, г. Кемерово

ВЗАИМОСВЯЗЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ  ГЕНОВ РЕЦЕПТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА С СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

Аннотация

Рецепторы врожденного иммунного ответа, такие как TREM-1 (Триггерный рецептор экспрессируемый на миелоидных клетках-1 типа) и TLRs (Toll-подобные рецепторы),  играют ключевую роль в воспалении. Однако вклад полиморфной изменчивости этих генов и их роль в патогенезе атеросклероза изучена недостаточно.

Ключевые слова: атеросклероз, гены, полиморфизм, рецепторы врождённого иммунного ответа, TLR, TREM-1.

Khutornaya M.V.¹, Ponasenko A.V.², Golovkin A.S.³

¹Associate Researcher; ²Leading Researcher, Acting Head of the Laboratory; ³MD, Ph.D., Head of the Department of Experimental and Clinical Cardiology, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases RAMS, Siberian Branch, Russia, Kemerovo

POLIMORPHISMS IN GENES OF RECEPTORS OF INNATE IMMUNITY ASSOCIATED WITH CARDIOVASCULAR DISEASE

Abstract

Receptors of the innate immune response, such as TREM-1(Trigger receptor expressed on myeloid cells-1 type) and TLRs (Toll-like receptors), play key a role in inflammation. However, the importance of polymorphisms in these genes and their role in the pathogenesis of atherosclerosis are not understood.

Keywords: atherosclerosis, genes, receptors of innate immunity, polymorphism, TLR, TREM-1.

Обзор отечественных и зарубежных публикаций научных исследований  по ассоциативным связям маркерных регионов генов рецепторов TLR1, TLR2, TLR4, TLR6 и TREM-1  с атеросклеротическим поражением сосудов, показал неоднозначность полученных результатов у разных авторов. [3,4,5]. При этом количество публикаций по данной теме крайне ограничено. Актуальность данного исследования определяется высокой частотой заболеваемости  атеросклерозом  населения  России, а   также отсутствием информация об ассоциативных связях аллельных вариантов генов врожденного иммунного ответа с риском развития этого заболевания в русской популяции.

Цель исследования: Оценить взаимосвязи аллельных вариантов 16 маркерных локусов генов рецепторов врожденного иммунитета TLR и TREM-1 с  риском формирования атеросклеротического поражения сосудов.

Материал и методы: Группу исследования составили  462 пациента, подвергшихся аортокоронарному шунтированию на базе ФГБУ «НИИ КПССЗ» СО РАМН,  г. Кемерово с 2011 по 2012 гг.  267 условно здоровых жителей Кемеровской области включены в группу контроля. Группы были сопоставимы по возрастным и гендерным признакам. Все участники исследования принадлежали к одной этнической группе - русские. Исследование одобрено Локальным Этическим Комитетом и проводилось после подписания информационного листа о добровольном согласии на участие в исследовании.

Материалом послужили образцы геномной ДНК, выделенные методом фенол-хлороформной экстракции с протеиназой К по модификации Smith с соавторами из цельной венозной крови [6]. Концентрации и качественные характеристики выделенной ДНК проверяли с использованием спектрофотометра NanoDrop-2000 (TFS, США). Генотипирование образцов осуществляли методом TaqMan с использованием флюоресцентно-меченных зондов производства Applied Biosystems (США). Для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (RT-PCR) [2] использовали образцы ДНК с концентрацией 5-20 нг/мкл. RT-PCR проводили с применением параметров рекомендованных производителем: активация AmpliTaq Gold-полимеразы (10 мин при 95°С), с последующим повтором 40 циклов, включающих денатурацию (92°С в течении 15 сек), отжигом/элонгацией (60°С в течении 1 мин) с последующей детекцией флуоресцентно меченных продуктов амплификации в конце каждого цикла. Исследовали маркерные локусы 5 генов: TREM-1 (rs1817537, rs3804277, rs6910730, rs7768162, rs2234246, rs4711668, rs9471535, rs2234237), TLR1 (rs5743551, rs5743611), TLR2 (rs3804099, rs5743708), TLR4 (rs4986790, rs4986791), TLR6 (rs3775073, rs5743810).

Полученные данные регистрировали в электронные таблицы  с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel 2003. Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета лицензионной программы «Statistica^® for Windows 6.0». При анализе результатов генотипирования учитывали соблюдение равновесия Харди-Вайнберга (тест χ2). Для попарного сравнения частот генотипов и аллелей между анализируемыми группами использовали критерий χ2 Пирсона с поправкой Йейтса на непрерывность. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05 [1]. Для оценки риска, предоставляемых определенными аллелями или генотипами, высчитывали отношения шансов (ОШ) с 95% доверительными интервалами (95% ДИ).

Результаты и их обсуждение:  Перед статистической обработкой полученных результатов мы проверили соответствие распределения частот встречаемости аллелей в исследуемых группах закону Харди - Вайнберга методом χ2. Распределение по всем исследуемым локусам было равновесным. Достоверные отличия по  распространенности аллельных вариантов между анализируемой и контрольной группами, были найдены по двум маркерным регионам генов TLR: TLR4 (rs4986790) и TLR6 (rs3775073). Так, у лиц, имеющих в генотипе 299Gly аллель гена TLR4, в гомозиготном или гетерозиготном состоянии, риск возникновения заболевания возрастает в 2 раза (ОШ=2.05, 95% ДИ=1.32-3.2, р=0.001). Протективный эффект обнаружен для  аллели 421Lys  гена TLR6. Гомозиготный генотип по этой аллели уменьшает риск развития атеросклероза на 40%  (ОШ=0.64, 95% ДИ= 0.41-0.99, р=0.048). Анализ по маркерным регионам гена TREM-1 выявил достоверные отличия между анализируемыми группами по четырём локусам: rs9471535, rs2234246, rs1817537 и rs3804277. При этом выявлено, что в маркёрном регионе rs9471535 значимой являлась минорная аллель T . Так наличие этой аллели  в генотипе в гомозиготном или гетерозиготном состоянии увеличивает риск развития заболевания в 1,5 раза (ОШ=1.48, 95% ДИ=1.01-2.16, р=0,04). При этом наличие одной из минорных аллелей: G rs1817537, G rs3804277 или G rs2234246 снижает риск формирования атеросклероза (соответственно ОШ=0.78, 95% ДИ=0.61-0.99, р=0.03; ОШ=0.71, 95% ДИ=0.52-0.99, р=0.04; ОШ=0.78, 95% ДИ=0.61-0.99, р=0.041).

При анализе ассоциаций, было установлено,  что наличие гаплотипа  GGG  (rs1817537-rs3804277-rs2234246) достоверно связано со сниженным риском развития атеросклероза (ОШ=0.77, 95% ДИ=0.6-0.98, р=0.037)

Выводы: В результате исследования выявлена ассоциация с увеличением риска развития атеросклероза для одного маркерного региона TLR4 (299Gly rs4986790) и одного гена TREM-1 (Т  rs9471535).  В качестве протективных выступала аллель 421Lys  TLR6 и три локуса гена TREM-1 (rs1817537, rs3804277, rs2234246) по минорным аллелям. При этом гаплотип TREM-1 GGG (rs1817537-rs3804277-rs2234246) так же являлся протективным.

Литература

1. Вейр Б. Анализ генетических данных. М.: Мир, 1995. C.400. 2. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J. Williams P.M. Real time quantitative PCR //Genome Research. 1996. №6. Р. 986-994.

3. Koch W., Hoppmann P., Pfeufer A., Schömig A., Kastrati A. Toll-like receptor 4 gene polymorphisms and myocardial infarction: no association in a Caucasian population. Eur Heart J. 2006; 27(21): 2524-9.

4. Lin Y.C., Chang Y.M., Yu J.M., Yen J.H., Chang J.G., Hu C.J. Toll-like receptor 4 gene C119A but not Asp299Gly polymorphism is associated with ischemic stroke among ethnic Chinese in Taiwan. Atherosclerosis. 2005; 180(2): 305-9.

5. Morange P.E., Tiret L., Saut N., Luc G., Arveiler D., Ferrieres J., Amouyel P., Evans A., Ducimetiere P., Cambien F., JuhanVague I. PRIME Study Group. TLR4/Asp299Gly, CD14/C-260T, plasma levels of the soluble receptor CD14 and the risk of coronary heart disease: The PRIME Study. Eur J Hum Genet. 2004; 12(12): 1041-9.

6. Smith К., Kliko С., Cantor C. Puls-elektroforez and methods of work with the big molecules of DNA // The Analysis of the genome. Methods: the Lane with English. М, World. 1990. 58–94.