PHENOTYPIC AND GENOMIC CHARACTERISTICS OF MICROORGANISMS ISOLATED DURING EXCAVATIONS OF PAZYRYK PERMAFROST BURIALS OF OLON-KURIN-GOL

¹Андреева И.С., ²Пилипенко А.С., ³Пучкова Л. И., ⁴Емельянова Е.К., ⁵Репин В. Е.,⁶Молодин В.И.

^1,2,3,4,5кандидат биологических наук федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», р.п. Кольцово Новосибирской области, Россия; ²кандидат биологических наук, институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия; ⁵ кандидат биологических наук, институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г., Новосибирск; ⁶академик, доктор исторических наук, институт археологии и этнографии СО РАН, Новосибирск, Россия.

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ГЕНОМНЫЕ ПРИЗНАКИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ПРИ РАСКОПКАХ МЕРЗЛОТНЫХ КУРГАНОВ ПАЗЫРЫКСКОЙ КУЛЬТУРЫ ОЛОН-КУРИН-ГОЛ

Аннотация

В настоящем сообщении представлены результаты микробиологических исследований мерзлотных могильников Олон-Курин-Гол-6 (курган № 2) и Олон-Курин-Гол-10 (курган № 1), уникальных, погребальных комплексов пазырыкской культуры, открытых в 2006 г. в Монголии на южном склоне Сайлюгемского хребта совместной российско-германско-монгольской экспедицией, возраст которых исчисляется в 2,5 тыс. лет (IV-III век до н.э.) [1]. Оценена численность и разнообразие обнаруженных культивируемых микроорганизмов, продукция ими ряда ферментов, устойчивость к антибиотикам, наличие плазмидных ДНК, патогенные свойства. На основе результатов анализа нуклеотидных последовательностей 16SpРНК и фенотипических признаков определена родовая  принадлежность большей части штаммов.

Ключевые слова: погребальные комплексы, Олон-Курин-Гол, микроорганизмы, идентификация

¹Andreeva I.S., ²Pilipenko A.S., ³Puchkova L. I., ⁴Emelyanova E.K., ⁵Molodin V.I.

^1,2,3,4,5Ph.D. of biological sciences, Federal State Research Institution State Research Center of Virology and Biotechnology Vector, Koltsovo, Novosibirsk region, Russia; ²Ph.D. of biological sciences, Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk, Russia; ⁵academician, Doctor of historical sciences, Institute of Archaeology and Ethnography SB RAS, Novosibirsk, Russia.

PHENOTYPIC AND GENOMIC CHARACTERISTICS OF MICROORGANISMS ISOLATED DURING EXCAVATIONS OF PAZYRYK PERMAFROST BURIALS OF OLON-KURIN-GOL

Abstract

The report presents the results of microbiological investigations of permafrost burials of Olon-Kurin-Gol-6 (tumulus # 2) and Olon-Kurin-Gol-10 (tumulus # 1), unique burial complexes of the Pazyryk Culture discovered in 2006 in Mongolia, on the southern slope of the Sailugem mountain ridge by the joint Russian-German-Mongolian expedition, which are 2500 years old (IV-III century B.C.) [1]. The number and diversity of detected viable microorganisms, their ability to produce some enzymes, antibiotic resistance, the presence of plasmid DNAs and pathogenic properties were evaluated. Based on the results of analysis of 16Sp RNA nucleotide sequences and phenotypic features, the strains most of the genera belonged to were determined.

Keywords: burial complexes, Olon-Kurin-Gol, microorganisms, identification

Комплекс методов, используемый в последнее время при исследовании палеопочв разновозрастных курганов эпох энеолита, бронзы, раннего железа и средневековья (IV тыс. до н.э.-XIV в. н.э.), позволил получить новые представления об истории развития почв и природной среды, оценить их роль в жизни древних обществ [1,2]. Исследование ДНК микроорганизмов из древних останков человека вносит вклад в палеоэпидемиологию [3]. Расшифровка информации, заключенной в достоверном фактическом материале, полученном при исследовании точно датированных археологических объектов, позволяет реконструировать палеоэкологическую обстановку существования человека в конкретном регионе и в определенное время, уточнить роль этих условий в формировании этносов прошлого [4]. В настоящей работе приведены данные по микробиологическому изучению содержимого погребальных камер древних захоронений Олон-Курин-гол.

Материалы и методы

Образцы для исследования. При раскопках курганов Олон-Курин-Гол отобраны образцы мерзлотных субстратов и органических останков из погребальных камер захоронений. Все работы проведены с соблюдением в асептических условий, образцы незамедлительно помещали в стерильные пластиковые контейнеры с герметично завинчивающимися крышками. Описание образцов и места их взятия представлены в таблице 1.

Условия выделения и культивирования микроорганизмов. Образцы 1, 2, 3а, 3б, 3в, 5, 6, 7, представляющие собой талый лед с включениями различной природы, после усреднения образца растиранием в стерильной ступке, высевали по 0,1 мл на чашки с плотной питательной средой. К 1 г необводненных образцов (4, 8, 9) добавляли по 1 мл физиологического раствора, выдерживали смесь на качалке при комнатной температуре в течение 15 мин, затем растирали пробу до однородности в стерильной ступке. На чашки с питательной средой высевали по 0,1 мл полученных суспензий и их десятикратных разведений. Все процедуры по выделению психрофилов выполняли с использованием охлажденных питательных сред, растворов и инструментов.

Таблица 1. Перечень образцов, взятых для микробиологического анализа

№ пробы	Образцы для исследования
Памятник: Олон-Курин-гол-6, курган 2.
1	Лед из центральной части сруба,  кристаллы льда на частицах грунта и камнях. Глубина 2 м
2	Лед из сруба с вмороженными кусочками древесины. Глубина 2 м.
3а, 3б, 3в	Лед из сруба, взят у северной стены. Крупная линза льда с вмороженными кусочками древесины и грунта. Глубина 2.1 м.
4	Останки мягких тканей лошади на глубине 170-180 см.
Памятник: Олон-Курин-гол-10, курган 1
5	Лед из сруба. Поверхность погребального ложа. Глубина 150 см.
6	Лед из сруба. Погребальное ложе. Части крупной линзы льда с вмороженными частицами грунта. Глубина 180 см.
7	Лед из северо-восточного угла сруба. Проба  взята из толщи льда (крупная линза) на глубине 5-10 см от поверхности линзы с помощью бура. Глубина 180 см.
8	Останки органических тканей лошади №1 Глубина 120-130 см.
9	Останки органических тканей лошади №2. Глубина 120-130 см.

Для выделения и культивирования микроорганизмов применяли питательные среды: рыбно-пептонный агар (РПА, ФГУП НПО «Микроген», МЗ РФ); жидкую и агаризованную среду LB (“Difсo”, США); крахмало-аммиачный агар [5], среду LB, разведенную дистиллированной водой в 5-10 раз. Высевы инкубировали при температурах 4, 20, 30, 37, 45 и 60°С. Выросшие колонии в течение 1-4 недель, отличающиеся морфологически, использовали для получения чистых культур.

Изучение морфологических свойств микроорганизмов Клетки микроорганизмов исследовали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия). Окраску клеток по Граму определяли методом [6], способность к образованию эндоспор – на РПА с добавлением MnSO₄× Н₂О в концентрации 0,005 г/л среды.

Физиологические и биохимические признаки, косвенные тесты на патогенность микробных изолятов выполняли в соответствии с [7]. Чувствительность к антибиотикам определяли с помощью аппликации дисков производства НИЦФ (Санкт-Петербург, Россия) на поверхность питательного агара, засеянного испытуемым микроорганизмом.

Наличие эндонуклеаз рестрикции в микроорганизмах определяли при скрининге отдельных колоний штаммов используя в качестве субстратов для гидролиза ДНК фагов lсI857 и Т7. Электрофорез ДНК после рестрикции проводили в 1%-ной агарозе фирмы “Sigma”(США). В работе применены ферменты и субстратные ДНК производства фирмы СибЭнзим (г. Новосибирск). Содержание плазмидной ДНК в штаммах определяли методом скрининга по стандартной методике [8]. Выделение суммарной ДНК из чистых культур проводили путем лизиса клеток 5M гуанидинтиоционатным буфером (pH 11.0) при 65°С с последующей экстракцией сначала смесью фенола и хлороформа (1:1), а затем хлороформом. Осаждение ДНК из водной фазы осуществляли изопропиловым спиртом в присутствии 1М NaCl. Образцы ДНК хранили при температуре минус 20°С. ПЦР проводили с универсальными праймерами, соответствующими гену 16S рРНК эубактерий: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ и 5`-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3`.  ПЦР проводили в режиме: 95°С – 3 мин (1 цикл); 95°С – 60 сек, 55°С – 60 сек, 72°С – 60 сек (30 циклов); 72°С – 5 мин (1 цикл). Нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР определяли с использованием BigDye 3,1 Terminator Cycle Sequencing Kit и автоматического анализатора ДНК модели ABI 3100 (Applied Biosystems, США), в Межинститутском Центре секвенирования ДНК СО РАН (г. Новосибирск; www.sequest.niboch.nsc.ru). При проведении секвенирующей реакции использовали внутренний праймер 5`-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3`. Полученные последовательности нуклеотидов гена 16S РНК сравнивали с последовательностями из международного банка данных NCBI c помощью пакета программ BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Результаты и обсуждение

Численность культивируемых микроорганизмов в образцах, отобранных в условиях мерзлоты, составляла от 1,4х10²  до 4,8х10⁴ КОЕ/мл пробы и в большинстве образцов была достаточно близка для выделенных мезофильных и психрофильных изолятов (таблица 2).

Таблица 2. Титр жизнеспособных микроорганизмов, выделенных из мерзлотных образцов и органических останков погребальных камер курганов Олон-Курин-Гол

Проба	Численность микроорганизмов (КОЕ/г или мл пробы)		Выделенные штаммы
	Мезофилы	Психротолеранты
1	4,8х103	7,2х103	Оk1 – Оk14, Ok75p - Ok 81p
2	2,7х104	1,3х104	Оk15 – Оk21, Ok82 - Ok84p Ok92 - Ok94p
3а	6,8х103	8,8х103	Оk22 – Оk26, Оk28, Ok30 – Ok 32, Ok85p - Ok 87p
3б	6,5х103	8,5х103	Оk27, Оk29, Оk33 – Оk35, Оk88р – Оk91р
3в	6,4х103	1,8х104	Ok36 - Ok41, Ok95p - Ok96p
4	3,4х104	1,5х104	Ok42 - Ok47, Ok97p - Ok99p
5	4,8х104	3,2х104	Ok51 - Ok54, Ok73t - Ok74t,  Ok100p - Ok103p
6	2,8х104	5,8х104	Ok48 - Ok50, Ok104p, Ok105
7	4,5х103	1,2х104	Ok55 - Ok60, Ok106p - Ok108p
8	1,4х102	2,8х103	Ok61, Ok63 - Ok68, Ok109p - Ok112p
9	1,9х103	1,6х104	Ok69 - Ok72, Ok113p, Ok114p

Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов. На основе результатов анализа нуклеотидных последовательностей (н.п.) 16SpРНК и фенотипических признаков микробных изолятов проведено определение их таксономической принадлежности. Преобладающими среди выделенных микроорганизмов были представители таких повсеместно широко распространенных родов неспороносных бактерий как Pseudomonas (30 штаммов), Arthrobacter (13 штаммов), Acinetobacter (9 штаммов). В меньшем количестве обнаружены бактерии родов Flavobacterium (2 штамма), Stenotrophomonas (3 штамма), Chryseobacterium (3 штамма), Terrabacter (2 штамма). В единичных количествах в полученной коллекции микробных изолятов курганов Олон-Курин-Гола присутствовали штаммы родов Microbacterium, Exiguobacterium, Agrococcus, Brevundimonas, Аeromicrobium, Planococcus, Pussilimonas. Выделены также грамположительные коринеморфные бактерии родов Rhodococcus (4 штамма), Nocardia (1 штамм) и три штамма актиномицетов рода Streptomyces. Бактерии, образующие эндоспоры, были представлены двумя родами: Bacillus (21 штамм) и Sporosarcina (2 штамма). На филогенетических деревьях исследуемые штаммы имеют пронумерованное обозначение «ОК», образуют ветви, как близкие по таксономической принадлежности к ранее известным эубактериям (95-100% сходства), так и далеко от них отстоящие, в том числе выявлены микроорганизмы, не имеющие известных аналогов в банке данных.

Штаммы рода Pseudomonas являются обычными обитателями холодных почв, составляя около 7% от всего количества выделяемых психротолерантных микроорганизмов. Штаммы этого рода, изолированные из исследуемых образцов (рис.1) как правило хорошо росли при 4, 20°С и 28-30°С, некоторые - при температуре от 4 до 45°С. К психрофилам, имеющим температурный оптимум ниже 10°С, можно было отнести штаммы Ok82р, Оk84р, Оk89р, Оk91р, Оk100р, Оk106р.

Рис. 1. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК эубактерий рода Pseudomonas,  построенное методом ближайших соседей.

Примечание: на рисунке указаны виды эубактерий и номера доступа в базе данных GenBank. В узлах указаны индексы поддержки кладистических групп.

Особое внимание обращают на себя плазмидосодержащие штаммы Pseudomonas sp. Оk92 и Оk27, для которых характерны такие признаки патогенности, как плазмокоагулирующая, гемолитическая, желатиназная и лецитиназная активности. Кроме того, эти штаммы проявили множественную устойчивость к антибиотикам. Для псевдомонад характерно наличие плазмид, несущих гены устойчивости к неблагоприятным факторам среды, включая антибиотики. С помощью экспресс-метода плазмидные ДНК различного молекулярного веса обнаружены у большинства штаммов выделенных псевдомонад.

Грамположительные, аэробные коринебактерии рода Arthrobacter, часто обнаруживаемые среди психротолерантных бактерий, также выделенны из исследуемых образцов (штаммы Ok4, Ok9, Ok35, Ok43, Ok60, Ok66, Ok71, Ok85р, Ok108р, Ok109р, Ok110р, Ok113р, Ok114р) (рис.2). В отличие от мезофильных бактерий этого рода, температурный оптимум у них был сдвинут в сторону пониженных температур - особенность, известная для многих микроорганизмов холодных и мерзлотных условий обитания [9,10]. Ферментативная активность штаммов в условиях опыта была слабо выражена. Эндонуклеазы рестрикции обнаружены у штаммов Оk85р и Оk109р, плазмидные ДНК – у штаммов Оk4, Оk9, Оk109р. Близкородственными микроорганизмами артробактерий являются выделенные аэробные коринеморфные бактерии родов Rhodococcus (штаммы Оk10, Оk13, Оk58, Оk70), Nocardia  (штамм Оk98р) и актиномицеты рода Streptomyces (штаммы Оk22, Оk26 и Оk65).

Штаммы рода Acinetobacter. В соответстви с результатами анализа н.п. 16SрРНК штаммы Оk45, Оk 48, Оk49, Оk50, Оk54, Оk57, Оk97р, Оk103р, Оk105р определены как принадлежащие к роду сапрофитных бактерий Acinetobacter  широко распространенных в почве и воде. Известно также, что штаммы Acinetobacter spp. входят в состав микрофлоры кожи, желудочно-кишечного и урогенитального тракта и могут относиться к патогенам.

 

 

Рис.2. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК эубактерий рода Arthrobacter, Agrococcus, Microbacterium, Terrabacter, Rhodococcus, Streptomyces, построенное методом ближайших соседей. На рисунке указаны виды эубактерий и номера доступа в базе данных GenBank. В узлах указаны индексы поддержки кладистических групп.

Клетки психротолерантных микробных изолятов, выделенных из образцов Олон-Курин-Гола и отнесенных к роду Acinetobacter, представляли собою грамотрицательные кокко-бациллы, кокки или укороченные, палочки, каталазоположительные, отрицательные по оксидазе и, как это свойственно представителям рода Acinetobacter, устойчивые к пенициллину (25 мкг/мл). Ферментативная активность штаммов этой группы была слабо выражена или в рамках проведенного тестирования отсутствовала. Признаки патогенности (гемолитическая, плазмокоагулазная, желатиназная, лецитиназная активности), выявляемые косвенным образом, у данных штаммов не были обнаружены.

Штамм Acinetobacter sp. Ok103р продуцировал эндонуклеазу рестрикции  (ЭР) Asp103I, являющуюся изошизомером ЭР BamHI,  представляющую биотехнологический интерес, так как максимальный уровень активности ЭР Asp103I проявляется при температуре 6-10°С. В настоящее время, в литературных источниках имеются сведения о изошизомерах данного фермента, однако, ни один из них не обладает температурным оптимумом ниже 20°С.

Грамположительные бактерии, образующие эндоспоры. Среди микроорганизмов, выделенных из мерзлотных образцов захоронения, преобладали неспороносные бактерии. В большинстве публикуемых работ указывается на малое содержание бактерий образующих эндоспоры в различных мерзлотных субстратах, либо их полное отсутствие. Отмечена высокая чувствительность бактериальных спор к негативным условиям среды в момент прорастания [11, 12]. Из 21-го штамма спорообразующих бацилл, выделенных из мерзлотных образцов, отобранных в камерах захоронения курганов Олон-Курин-Гола, 16 штаммов оказались мезофиллами, оптимальная температура роста этих штаммов составляла 20-28°С. Большая часть из них образовывала эллиптические эндоспоры, расположенные в клетке центрально или терминально. Исключением были штаммы Оk38 и Оk76р формирующие сферические эндоспоры терминального расположения, значительно превышающие диаметр клеток, аналогично клеткам известного вида Bacillus sphaericus. Для тринадцати штаммов бацилл показано наличие протеаз. Семь из них дополнительно продуцировали зкзонуклеазы. За исключением штамма Оk14 для всех бацилл была характерна каталазная активность, выраженная в разной степени, не обнаружены эндонуклеазы рестрикции; амилолитическая и липолитическая активности выявлены у единичных штаммов. Штамм Bacillus sp. Оk39 обладал наибольшей ферментативной активностью (шестью из восьми тестированных) и обнаружил при этом три косвенных фактора патогенности: лецитиназную, гемолитическую и желатиназную активности, проявил устойчивость к четырем широко применяемым антибиотикам - стрептомицину, гентамицину, эритромицину и левомицетину.

Штаммы Оk33, Оk72 и Оk88 отнесены к роду Sporosarcina в соответствии с данными анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК. Из микроорганизмов этого рода наиболее известна подвижная, спороносная уробактерия Sporosarcina ureae, обитающая в почве, моче, навозе, сточных водах и в воде очистных сооружений, способная расти в условиях щелочных сред  [13]. Известны психрофильные представители этого рода, такие как  Sporosarcina antarctica [14], Sporosarcina psychrophila и целый ряд других видов. Штаммы Sporosarcina sp. Оk72 и Оk88 являются психротолерантными, имеют фенотипические признаки характерные для представителей рода Sporosarcina, подтверждающие таксономическое определение штамма Оk72, полученное при анализе нуклеотидной последовательности 16S pРНК.

Грамотрицательные и грамположительные неспороносные бактерии, обладающие факторами патогенности. В эту группу условно объединены бактерии нескольких родов, не образующие эндоспоры:  штаммы родов Terrabacter (штаммы Ok2 и Ok61), Stenotrophomonas (штаммы Ok6, Ok16 и Ok46), Agrococcus (штамм Ok32), Exiguobacterium (штамм Ok32), Microbacterium (штамм Ok55), Chryseobacterium (штаммы Ok56, Ok59, Ok67) и штамм Ok64, отнесенный к Brevundimonas.  Штаммы Ok2, Ok61 по н.п. 16S РНК имеют 98-99% гомологии с представителями рода Terrabacter [15], обладают рядом признаков, характеризующих бактерии этого рода: имеют сферические, грамположительные клетки, с оптимум роста в пределах 20-30°С, не сбраживают глюкозу, отрицательны по оксидазе и имеют выраженную гемолитическую активность, для более точной идентификации штаммов Ok2 и Ok61 нужны дополнительные исследования.

Штаммы Ok6 и Ok16, определенные в соответствии с результатами анализа н.п. 16S рРНК как Stenotrophomonas sp., обладают рядом сходных черт с бактериями этого рода: имеют грамотрицательные, палочковидные клетки, проявляют множественную, высокую устойчивость к антибиотикам, обладают гемолитической и желатиназной активностями. Для них также характерно наличие высокой протеолитической, липолитической и экзонуклеазной активности.

Более детального рассмотрения заслуживают неферментирующие, грамотрицательные, гемолитические штаммы Ok-56, Ok-59 и Ok-67, определенные как Chryseobacterium sp. Основные клинические формы проявления инфекций, вызываемых Chryseobacterium meningisepticum  - менингит и бактериемия. Выделенные в работе штаммы, как свойственно батериям этого рода, обладают устойчивостью ко многим антимикробным препаратам, применяемым для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. На агаризованных средах эти штаммы образуют полупрозрачные колонии темно-желтого цвета, что обусловлено синтезом водонерастворимого пигмента флексирубина [16].

Неидентифицированные штаммы Ok19, Ok52, Ok62, Ok68, Ok69, Ok78р, Ok83р, Ok89р, Ok94, Ok95p, Ok100р, Ok101р, Ok104р, Ok107р, Ok111 и ряд других по первичным данным являются палочковидными, неспорообразующими, неферментирующими, грамотрицательными или грамположительными, психротолерантными бактериями, растущими в диапазоне температур 4 - 30°С. Детальная идентификации этих штаммов затруднительна ввиду очень слабого роста  или его отсутствия при повторных попытках культивирования.

Следует отметить, что около 40% штаммов от общего количества выделенных 114 изолятов обладали гемолитической активностью и другими косвенными факторами патогенности. Среди них – 12 штаммов мезофильных бактерий Bacillus ssp., 5 штаммов Artrobacter ssp., а также – штаммы, идентифицированные как представители родов Stenotrophomonas,, Chryseobacterium, в составе которых известно большое количество высокопатогенных видов, и ряд других.

Тем не менее, несмотря на значительное количество условно патогенных штаммов, обнаруженных в образцах, взятых в погребальных камерах курганов, нет возможности говорить определенно об их причастности к болезни или смерти объектов захоронения, так как микроорганизмы упомянутых родов повсеместно встречаются в почве, воде, в составе нормальной микрофлоры людей и животных.