BACILLUS THURINGIENSIS STRAINS SECRETING METABOLITES INHIBIT THE REPLICATION OF HUMAN INFLUENZA VIRUS A/AICHI/2/68 (H3N2) AND AVIAN INFLUENZA VIRUS A/CHICKEN/KURGAN/05/2005

¹Андреева И.С., ²Мазуркова Н.А., ³Мокрушина О.С., ⁴Пучкова Л.И., ⁵Закабунин А.И.

^{1, 2,3,4,5}кандидат биологических наук, ³аспирант, ФБУН государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», п. Кольцово Новосибирской обл., Россия;⁵Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск, Россия

ШТАММЫ BACILLUS THURINGIENSIS, СЕКРЕТИРУЮЩИЕ МЕТАБОЛИТЫ, ПОДАВЛЯЮЩИЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ВИРУСА ГРИППА ЧЕЛОВЕКА A/AICHI/2/68 (H3N2) И ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ A/CHICKEN/KURGAN/05/2005

Аннотация

Исследована возможность подавления размножения вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) на культуре ткани MDСK водорастворимыми метаболитами штаммов Bacillus thuringiensis. Проведенные исследования показали, что наряду с отсутствующей или незначительной токсичностью исследуемые опытные образцы препаратов показали высокую активность против вирусов гриппа, что делает перспективным дальнейшую их разработку в целях борьбы с вирусами гриппа человека и птиц.

Ключевые слова: вирусы гриппа, Bacillus thuringiensis, водорастворимые метаболиты, противовирусная активность.

¹Andreeva I.S., ²Mazurkova N.A., ³Mokrushina O.S., ⁴Puchkova L.I., ⁵Zakabunin A.I.

^{1, 2,3,4,5}Ph D in biology , ³Postgraduate stuent, FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”, Koltsovo, Novosibirsk region, Russia; ⁵Institute of Chemical Biology and Functional Medicine SB RAS, Novosibirsk, Russia

BACILLUS THURINGIENSIS STRAINS SECRETING METABOLITES INHIBIT THE REPLICATION OF HUMAN INFLUENZA VIRUS A/AICHI/2/68 (H3N2) AND AVIAN INFLUENZA VIRUS A/CHICKEN/KURGAN/05/2005

Abstract

The possibility of inhibiting the replication of human influenza virus A/Aichi/2/68 (H3N2) and avian influenza virus A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) on MDCK tissue culture by water-soluble metabolites of Bacillus thuringiensis strains was studied. The performed investigations showed that along lacking or insignificant toxicity the studied pilot samples of the preparations demonstrated high activity against influenza viruses, which makes promising their further development for control of human and avian influenza viruses.

Keywords: influenza viruses, Bacillus thuringiensis, water-soluble metabolites, antiviral activity.

Одна из новых стратегий разработки противовирусных препаратов состоит в выделении активных соединений из продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Большой интерес исследователи проявляют к экологически безопасным штаммам бактерий рода Bacillus, продуцирующих большой спектр биологически активных веществ. Получены данные по активности штамма В. pumilus «Пашков» в отношении вируса полиомиелита I типа, вирусов ECHO 3 и ECHO6, вирусов Коксаки [1], по противовирусной активности штамма B. thuringiensis VNPB 17-3, продуцирующего белковый токсин, обладающий активностью против вируса табачной мозаики [2]. В настоящей работе исследованы противовирусные свойства штаммов Bacillus thuringiensis (Bt) относительно вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1).

Материалы и методы.

Приготовление образцов для испытания. Для тестирования на противовирусную активность были отобраны штаммы Bt, отличающиеся морфологией, биохимическими свойствами, антимикробной активностью, особенностями кристаллообразования: штаммы Bt ssp. kurstaki АК-5 (Н3abc), колл. № В-1276; Bt ssp. finitimus АК-3 (Н2), колл. № В-1274; штамм Bt АК-1, колл. № В-1272 и штамм Bt АК-2, колл. № В-1273, депонированные в «Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»». Посевной материал получали при выращивании штаммов Bt на жидкой или агаризованой среде LВ (“Difco”, США). Контроль морфологии клеток и наличие параспоральных включений оценивали с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Germany) используя фазово-контрастную микроскопию.

С использованием культуры исследуемого штамма, наработанного на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 30°С, готовили суспензии клеток с концентрацией 1×10⁷ кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы со средой LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки (КТ 104, Россия) при температуре 30°С. Для приготовления препарата полученную культуральную жидкость штамма (КЖ) центрифугировали при 6000 об./мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтры и хранили до использования при температуре минус 20^°С.

Определение токсичности и противовирусной активности препаратов. Для тестирования токсичности и противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученную из «Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»». В асептических условиях суспензию с известной концентрацией клеток MDCK разводили средой RPMI-1640 до концентрации 1×10⁵ кл./мл и по 100 мкл вносили в лунки 96-луночных планшетов. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37ºC, 5% СО₂ и 100% влажности на 2-3 суток до образования монослоя. Препараты разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и ставили в термостат при температуре 37ºC, 5% СО₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. При определении противовирусной активности препаратов использовали максимально переносимые концентрации (МПК).

Для определения противовирусной активности препаратов готовили десятикратные разведения вирусалантоисной жидкости (ВАЖ) с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл выбранного разведения препарата и 100 мкл разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37ºC в атмосфере 5% СО₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

Результаты и обсуждение

Выяснено, что используемые в опыте препараты были нетоксичны или слабо токсичны для клеток MDCK и в разной степени подавляли вирусы гриппа используемые в опыте (таблица 1). Наименьшей токсичностью для клеток MDCK обладали препараты на основе штаммов Bt АК-1 (В-1272) и Bt АК-2 (В-1273), наиболее выраженной токсичностью обладал препарат штамма Bt ssp. kurstaki АК-5 (В-1276), проявляющейся до 10 разведения (таблица 1).

Таблица 1. Испытание образцов на токсичность относительно клеток MDCK

Образец (КЖ штамма)

Исходная концентрация

Разведения

Контроль клеток

в 2 раза

в 5 раза

в 10 раз

в 20 раз

В-1272

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

В-1273

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

В-1274

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

В-1276

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

Обозначения: +  есть токсичность; -  нет токсичности препарата (2 повтора опыта).

В тесте на определение противовирусной активности наиболее результативным относительно вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) оказались штаммы Bt ssp. kurstaki АК-5 (В-1276) и штамм Bt АК-1 (В-1272). По отношению к вирусу гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) лучший антагонистический результат показали штаммы Bt ssp. finitimus АК-3 (В-1274) и Bt ssp. kurstaki АК-5 (В-1276) (таблица 2). Следует отметить также, что исследуемые препараты обладали выраженной РНК-азной активностью, что может явиться одной из причин подавления ими размножения РНК-содержащих вирусов, к которым относятся вирусы гриппа.

Таблица 2. Противовирусная активность препаратов

Образец (КЖ штамма)	Титр вируса в lg ТЦД50 /мл через 48 ч (профилактическая схема)
	A/Aichi/2/68 (H3N2)			A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)
	Опыт 1	Опыт 2	Опыт3	Опыт 1	Опыт 2	Опыт3
В-1272	0	0,5	0	2,5	3,3	3,5
В-1273	2,5	3,0	2,1	2,4	3,0	3,1
В-1274	2,5	3,2	2,0	1,3	1,7	2,0
В-1276	0	0	0	0	0,6	0,7
Контроль вируса	3,5	4,0	3,0	6,5	7,0	7,2

Прмечание: при исследовании противовирусной активности образцы были разведены в 2 раза.

Поиск действующего начала препаратов Bt проводили путем фракционирования компонентов культуральной жидкости штаммов с последующим определением специфической активности. В качестве методов фракционирования использовали ионообменную хроматографию (разделение по заряду), ультрафильтрацию (разделение по молекулярной массе), высаливание сульфатом аммония. Предварительный анализ отдельных полученных фракций подтвердил наличие высокой противовирусной активности исследуемых метаболитов штаммов Bt, работы по их выделению и идентификации будут продолжены.

В результате проведенных исследований показано, что препараты, приготовленные на основе КЖ испытанных штаммов Bt, эффективно подавляют размножение вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) на клетках MDCK, что позволяет считать их перспективными для дальнейшей разработки противовирусных препаратов.