CHLORIDE ANIONS ARE REQUIRED FOR THE ENZYMATIC ACTIVITY OF SERUM HYALURONIDASE

Research article
DOI:
https://doi.org/10.60797/IRJ.2024.144.59
Issue: № 6 (144), 2024
Suggested:
21.05.2024
Accepted:
04.06.2024
Published:
17.06.2024
96
3
XML
PDF

Abstract

The present study presents results demonstrating the necessity of the presence of chlorine anions for the manifestation of hyaluronidase activity of blood serum of Wistar rats. In our previous studies it was shown that sodium and potassium chlorides alone, compared to other halides of these cations, caused a several-fold increase in enzyme activity, while no differences between sodium chloride and potassium chloride were found in their effect on hyaluronidase activity. In this work, the creation of an acidic incubation environment required for enzymatic activity was created by adding hydrochloric or acetic acid to the buffer (0.1 M sodium acetate) to a final pH of 3.7. It was demonstrated that if the pH was adjusted with hydrochloric acid, hyaluronidase activity could be observed, which was completely absent if the pH of the enzyme incubation medium was adjusted with acetic acid. It is concluded that chlorine anions are required for the hyaluronidase activity of serum.

1. Введение

Гиалуроновая кислота, являясь основным структурным компонентом соединительной ткани, представляет собой гигантский гетерополисахарид, содержащий большое количество отрицательных зарядов, связывающих и удерживающих в тканях диполи воды и различные катионы

. На сегодняшний день многочисленные литературные данные демонстрируют участие этого полимера в таких физиологических процессах, как клеточное деление, пролиферация и миграция клеток, регуляция водно-электролитного обмена
. Также продемонстрировано участие гиалуроновой кислоты в формировании целого ряда патологических состояний, таких как онкологические заболевания, сахарный диабет, артриты
,
. Такое разнообразие эффектов, очевидно, связано с регуляторной ролью гиалуроной кислоты, в зависимости от степени полимеризации которой влияние может быть прямо противоположным. В крови человека и ряда млекопитающих обнаружена значительная гиалуронидазная активность, связанная с сывороточной гиалуронидазой, циркулирующей по организму
. На сегодняшний день нет ясного представления о роли этого фермента с кислым рН-оптимумом, что делает изучение катаболизма гиалуроновой кислоты насущной и актуальной задачей.

В нашем предыдущем исследовании было показано, что ионы хлора могут играть существенную роль в активировании сывороточной гиалуронидазы, поскольку замена хлоридов натрия и калия на фториды и бромиды лишала соли этих катионов активирующего влияния

. В связи с этим представляло интерес выяснить, будет ли проявляться гиалуронидазная активность в среде инкубации, в которой отсутствуют анионы хлора.

2. Методы и принципы исследования

В экспериментах использовали крыс линии Вистар обоего пола массой около 300 г, которые содержались в стандартных условиях вивария ad libitum. Крыс декапитировали и собирали кровь в центрифужные пробирки. После сворачивания крови пробирки центрифугировали 5 минут при 600 g, надосадочную жидкость отбирали и использовали в дальнейших экспериментах. Эксперименты на лабораторных животных проводились в полном соответствии с теми этическими нормами и правилами, которые утверждены правовыми актами Российской Федерации и соответствуют рекомендациям биоэтического комитета Института биомедицинских исследований Владикавказского Научного центра Российской академии наук.

Гиалуронидазную активность определяли по флюориметрическому методу Такахаши с использованием реакции Моргана-Эльсона в модификации Рейсига

. Сыворотку крови (10 мкл) инкубировали при 370 С в течение 3 часов в среде инкубации (140 мкл), содержащей 0,5 мг/мл высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (ООО «НПО АЛЬФАРМ», Ростов-на-Дону, Россия). В среде инкубации отсутствовал хлорид натрия, а в качестве буфера использовали 0,1М ацетат натрия (VWR International LLC, США), рН 3,7. Для подавления сопутствующей экзогидролазной активности в среду инкубации добавляли 0.02М слизевой кислоты. рН реакционной среды доводили до 3,7 добавлением концентрированной соляной кислоты или добавлением ледяной уксусной кислоты. Флюоресценцию измеряли при волне возбуждения – 545 нм, эмиссии – 602 нм (Флюорат – 2М, ЛЮМЭКС, Санкт-Петербург, Россия). За единицу активности гиалуронидазы принимали количество фермента, необходимого в данных условиях реакции для образования 1 микромоля концевого n-ацетилглюкозамина за 1 мин. Использованные химические реактивы отечественного производства имели градацию не ниже «хч».

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони. Экспериментальные данные, представленные в работе, являются средними значениями ± ошибка среднего (M±m).

3. Результаты и их обсуждение

На рисунке представлена гиалуронидазная активность сыворотки крови крыс линии Вистар. рН среды инкубации, в которой инкубировалась сыворотка, доводили до значения 3,7 добавлением в первом случае концентрированной соляной кислоты, а во втором случае добавлением ледяной уксусной кислоты.
Гиалуронидазная активность сыворотки крови крыс линии Вистар

Рисунок 1 - Гиалуронидазная активность сыворотки крови крыс линии Вистар

Примечание: рН среды инкубации (3,7) создавали добавлением соляной кислоты (HCl) или уксусной кислоты (CH3COOH); звездочкой обозначены достоверные отличия при p < 0,001; результаты представляют средние значения 5 отдельных экспериментов

Как видно из рисунка, когда необходимое рН среды инкубации создавалось добавлением соляной кислоты, значение гиалуронидазной активности сыворотки крови составляло, в среднем, 2,7 мЕ/мл, что хорошо согласуется с нашими ранее полученными результатами по определению гиалуронидазной активности сыворотки крови крыс линии Вистар
,
. Когда же доведение рН среды инкубации до 3,7 обеспечивалось добавлением уксусной кислоты, то гиалуронидазная активность сыворотки крови полностью подавлялась. Следует отметить, что, по сравнению с нашими предыдущими исследованиями, в данном исследовании в качестве буфера использовался ацетат натрия (0,1 М), и в среде инкубации отсутствовал хлорид натрия. Поэтому, источником анионов хлора могла выступать только соляная кислота, которая использовалась для создания кислой рН среды. Во втором случае добавление ледяной уксусной кислоты создавало соответствующую рН среды, но не вносило в среду инкубации анионов хлора, вместо которых присутствовали ацетат-анионы.

Полученные результаты позволяют предположить обязательное присутствие анионов хлора в среде инкубации для проявления сывороточной гиалуронидазной активности. Однако, утверждать, что анионы хлора оказывают непосредственное влияние на фермент, не представляется возможным, поскольку в сыворотке крови присутствуют ингибиторы гиалуронидаз, о которых на сегодняшний день мало, что известно

. Таким образом, дозо-зависимое влияние хлоридов на гиалуронидазную активность может быть связано с непосредственным влиянием не на сывороточную гиалуронидазу, а на ее ингибиторы. Для прояснения этого вопроса требуются дальнейшие исследования.

Также нельзя исключать той возможности, что уксусная кислота может подавлять активность сывороточной гиалуронидазы. В самом начале исследований активности гиалуронидаз в литературе появились сведения о том, что ацетат может ингибировать гиалуронидазную активность

. В связи с этим, традиционно, в исследованиях сывороточной гиалуронидазной активности, чаще всего, применяют в качестве буфера натриевую соль муравьиной кислоты, добавлением которой и создают кислую среду. Также, как правило, в среде инкубации присутствует хлорид натрия (0,1 М)
. В наших экспериментах применение ацетата натрия в качестве буфера в отсутствие в среде инкубации сыворотки крови хлорида натрия не вызывало ингибирования гиалуронидазной активности, если рН доводили соляной кислотой. Этот факт, на наш взгляд, подтверждает представление о том, что причиной подавления активности сывороточной гиалуронидазы, когда рН среды доводили уксусной кислотой, является не присутствие ацетата в среде инкубации, а отсутствие в ней ионов хлора.

4. Заключение

Хлорид натрия, являясь основным минеральным компонентом крови млекопитающих и человека, оказывает регулирующее влияние на гиалуронидазу сыворотки крови. В этом влиянии главную роль выполняют анионы хлора, которые необходимы для проявления ферментативной активности сывороточной гиалуронидазы на примере крыс линии Вистар. Регулирующее влияние ионов хлора может быть связано с непосредственным воздействием на активный центр фермента, или же опосредовано влиянием на ингибиторы гиалуронидаз, циркулирующих в крови.

Article metrics

Views:96
Downloads:3
Views
Total:
Views:96