DEVELOPMENT OF THE SEPARATION AND IDENTIFICATION DIAGRAM OFAEROMONAS SALMONICIDA BACTERIA

Куклина Н.Г.¹, Васильев Д.А.², Нафеев А.А.³

¹научный сотрудник,

²Доктор биологических наук, профессор,

³Доктор медицинских наук

ФГБОУ ВО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»

РАЗРАБОТКА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИИ AEROMONAS SALMONICIDA

Аннотация

Представлена бактериологическая схема выделения и идентификации бактерии A. salmonicida с использованием оригинальных питательных сред и комплекса бактериологических тестов. Разработанные питательные среды специфичны по отношению к бактериям-ассоциантам других видов и родов. Предлагаемая схема предполагает выделение и идентификацию микроорганизма за 60-84 часа. В результате апробирования данной схемы было выделено 17 штаммов A. salmonicida из 97 проб, отобранных из водных объектов г. Ульяновска и Ульяновской области.

Ключевые слова: аэромоноз, бактериологическая схема выделения, питательные среды, A. salmonicida.

Kuklina N.G.¹, Vasiliev D.A.², Nafeev A.A.³

¹Research scientist,

²PhD in Biology, Professor,

³MD,

Ulyanovsk State Agricultural Academy named after P.A. Stolypin

DEVELOPMENT OF THE SEPARATION AND IDENTIFICATION DIAGRAM OFAEROMONAS SALMONICIDA BACTERIA

Abstract

A diagram for separation and identification of bacterium A. Salmonicida using original nutrient media and a complex of bacteriological tests is presented in the paper. The developed nutrient media are specific with regard to bacteria-associates of other species and genus. The proposed scheme assumes separation and identification of the microorganism in 60-84 hours. As a result of the testing of this scheme, 17 strains of A. Salmonicida were detected in 97 samples taken from water bodies in Ulyanovsk and the Ulyanovsk region.

Keywords: aeromonose, bacteriological separation diagram, nutrient media, A. Salmonicida.

Бактерия A. salmonicida является возбудителем фурункулеза (аэромоноза) рыб не только представителей семейства лососевых, но и других семейств. Фурункулез-это высококонтагиозная болезнь, протекающая остро, подостро и хронически. Зараженные рыбы с открытыми ранами являются источниками распространения A. salmonicida. В связи с высокой плотностью выращивания рыбы в хозяйствах, эта болезнь быстро распространяется с высоким процентом летальности [1, С. 136].

Согласно Инструкции о мероприятиях по профилактике и мерам борьбы с фурункулезом лососевых рыб от 26.11.1997 №13-4-4/1090 Диагноз на фурункулез устанавливают на основании эпизоотических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений, результатов бактериологического исследования и положительной биопробы, которое занимает до 10 дней [2].

Нами была разработана бактериологическая схема выделения и идентификации данного вида микроорганизма, включающая специальные среды – жидкую накопительную среду A.Sl.1-УГСХА, плотную селективную среду A.Sl.2-УГСХА и ряд бактериологических тестов, которая позволяет сократить время на исследование до 84 ч.

При конструировании питательных сред подбор питательных веществ осуществлялся экспериментальным путем. В результате исследований жидкая среда A.Sl.1-УГСХА имеет следующий состав: вода дистиллированная - 1000 мл, K₂HPO₄ - 1г, MgSO₄ - 0,2 г, NaCl- 5г, пептон -5 г, бромтимоловый синий - 0,03 г, глюкоза - 5 г, BaCl₂ - 2 г. pH готовой среды накопления = 7,1. Способ приготовления - в дистиллированную воду добавляют пептон, минеральные соли, глюкозу, бромтимоловый синий. Среду доводят до полного растворения частиц, разливают в стерильные пробирки по 5 мл и автоклавируют при 0,5 атм в течение 20 минут. Готовая среда прозрачная, травянисто-зеленого цвета.

Нами была разработана плотная дифференциально-диагностическая среда A.Sl.2-УГСХА следующего состава - вода дистиллированная - 1000 мл, агар - 15 г, пептон - 5 г, дрожжевой экстракт - 3 г, MgSO₄ - 0,2 г, K₂HPO₄ - 1 г, глюкоза - 5 г, конго-рот - 3 г. Концентрацию указанных компонентов также была подобрана экспериментальным путем.

Способ приготовления – все компоненты смешивали и доводили до кипения. Затем автоклавировали в течение 20 минут при 112° С. pH готовой среды накопления – 7,1. Готовая среда – насыщенного красного цвета.

С целью определения специфичности, разработанных нами сред накопления, был проведен контрольный посев бактерий-ассоциантов других видов и родов. Посевы культивировали в термостате в течение 24 ч. при Т- 28ºС: A. salmonicida АТСС 33658, Ps. putida №12633, Ps. fluorescens №13525, Y. ruckeri №6, Y.enterocolitica; при Т - 37 ºС: Ps. aeruginosa №128, A. hydrophila ATCC 49140, A. sobria ATCC 9071, A. caveae ATCC 12633, P. mirabilis №523, Kl. pneumonia №4463, E. coli №4 (табл.1).

Таблица 1 – Определение специфичности жидкой среды накопления A.Sl.1-УГСХА и дифференциально-диагностической среды A.Sl.2-УГСХА

№ п/п	Вид бактерий	Рост на жидкой среде A.Sl.1-УГСХА	Контроль на МПБ	Рост на плотной среде A.Sl.2-УГСХА	Контроль роста на чашках Петри с МПА
1.	A. salmonicida АТСС 33658	Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый	Наличие роста, помутнение бульона.	мелкие, округлые, черного цвета, размером 0,2-0,5 мм, с гладкой поверхностью. Цвет среды рядом с колониями изменяется на черный.	+
2.	A. hydrophila АТСС 49140	Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый	Наличие роста, помутнение бульона	Колонии крупные, диаметром до 1 мм, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный.	+
3.	A. sobrea АТСС 9071	Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый	Наличие роста, помутнение бульона	мелкие, округлые, черного цвета, размером 0,5-0,7 мм, с гладкой поверхностью. Цвет среды рядом с колониями изменяется на черный.	+
4.	A. caviae АТСС 15468	Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый	Наличие роста, помутнение бульона	Колонии мелкие, диаметром до 0,7 мм, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный.	+
5.	Ps. aeruginosa №128	Отсутствие роста, цвет среды не изменился.	Наличие роста, помутнение бульона	Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный.	+
6.	Ps. putida №12633	Отсутствие роста, цвет среды не изменился.	Наличие роста, помутнение бульона	Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный.	+
7.	Ps. fluorescens №13525	Отсутствие роста, цвет среды не изменился.	Наличие роста, помутнение бульона	Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный.	+
8.	P. mirabilis №523	Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый	Наличие роста, помутнение бульона	Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный.	+
9.	Y. ruckeri №6	Отсутствие роста, цвет среды не изменился.	Наличие роста, помутнение бульона	Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный.	+
10.	Y. enterocolitica	Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый	Наличие роста, помутнение бульона	Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный.	+
11.	Kl.pneumonia №4463	Отсутствие роста, цвет среды не изменился.	Наличие роста, помутнение бульона	Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный.	+
12.	E. coli №4	Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый	Наличие роста, помутнение бульона	Колонии крупные до 2 мм в диаметре, округлые, имеют серый цвет.	+

Этапы исследования по разработанной нами схеме.

Исследуемую пробу воды в количестве 1 мл вносят в накопительную среду A.Sl.1- УГСХА объемом 4-5 мл и помещают в термостат на 18 ч при температуре 28°С. На жидкой накопительной среде бактерии рода Aeromonas дают положительную реакцию, характеризующуюся изменением цвета среды с зеленого на желтый, а также помутнением субстрата и образованием осадка. Затем из жидкой среды накопления, бактериологической петлей делается посев на плотную дифференциально-диагностическую среду A.Sl.2-УГСХА и инкубируются 18 ч при температуре 28ºС.

На среде A.Sl.2-УГСХА бактерии A. salmonicida образуют колонии округлой формы, размером 0,5-1 мм черного цвета, цвет среды вокруг колоний также чернеет.

Выросшие на селективной среде A.Sl.2-УГСХА колонии параллельно исследуют по тестам – на желатиназную активность, наличие нитратредуктазы, подвижность, OF-тест, а также пересевают отдельно стоящие колонии на МПА для последующего определения окраски по Граму и микроскопии, наличия каталазной и оксидазной активности.

Производят окраску по Граму и микроскопию. Клетки A. salmonicida выявляются как грамотрицательные палочки.

Для определения ферментов оксидазы и каталазы производят посев выросших на среде A.Sl.2-УГСХА колоний на чашки Петри с мясопептонным агаром. После инкубирования при 28ºС в течение 18 ч на поверхность выросших на мясопептонном агаре колоний наносят 1% раствор 2-N-диметилпарафенилендиамина для определения оксидазы и 3% раствор перекиси водорода для определения каталазы. A.salmonicida является оксидазоположительной (покраснение реактива в течение 20 сек) и каталазоположительной (образование пузырьков газа).

Определяют подвижность методом укола в столбик застывшего 0,3% мясопептонного агара. После инкубирования в течение 18 ч при 28ºС проводят учет результатов. Бактерии A. salmonicida неподвижны (наличие роста микроорганизмов на полужидком агаре только по линии укола). Исследуют способность восстанавливать нитраты в нитриты. Для этого производят посев при помощи бактериологической петли в МПБ с нитратом калия. После инкубирования при 28ºС 18 ч в пробирки добавляют реактив - дистиллированная вода с крахмалом и йодистым калием и 10% водный раствор хлористоводородной кислоты. В результате происходит темно-синее окрашивание среды, т.к. A. salmonicida способна к нитратредуктазе.

Уколом производится посев в пробирки с тестом на наличие желатиназы. После инкубирования в течение 18 ч при 28ºС проводят учет результатов. Бактерии A. sаlmonicida разжижают желатин (среда в засеянной пробирке жидкая, в контрольной пробирке среда загустевает).

Для исследования способности микроорганизмов к ферментации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях готовят среду Хью-Лейфсона. После инкубирования 24-48 ч при Т=28ºС проводят учет результатов, A. salmonicida способна к ферментации глюкозы как в аэробных, так и в анаэробных условиях (изменение цвета в пробирках с зеленого на желтый как в аэробных условиях, так и в анаэробных условиях).

В результате использования данной схемы при исследовании 97 проб воды из объектов водной среды г. Ульяновска и Ульяновской области нами было выделено 17 штаммов A. salmonicida.

Список литературы / References

1. Головина, Н. А. Ихтиопатология / Н. А. Головина, Ю. А. Стрелков, В. Н. Воронин, П. П. Головин, Е. Б. Евдокимова, Л. Н. Юхименко. Под ред. Н. А. Головиной, О. Н. Бауера. — М.: Мир, 2003. — 448 с.: ил.
2. Инструкция о мероприятиях по профилактике и мерам борьбы с фурункулезом лососевых рыб от 26.11.1997 №13-4-4/1090. – URL: http://www.cap.ru/home/65/aris/bd/vetzac/document/402.html (дата обращения: 28.03.2017).

Список литературы на английском языке / References in English

1. Golovina, N. A. Ihtiopatologija [Ichthyopathology] / N. A. Golovina, Ju. A. Strelkov, V. N. Voronin, P. P. Golovin, E. B. Evdokimova, L. N. Juhimenko. Pod red. N. A. Golovinoj, O. N. Bauera. — M.: Mir, 2003. — 448 p.: il. [in Russian]
2. Instrukcija o meroprijatijah po profilaktike i meram bor'by s furunkulezom lososevyh ryb ot 26.11.1997 №13-4-4/1090 [Instruction on measures for prevention and control of salmonid furunculosis]. – URL: http://www.cap.ru/home/65/aris/bd/vetzac/document/402.html (accessed: 28.03.2017). [in Russian]