THE IMPACT OF SINGLET OXYGEN INHALATION ON THE ACTIVITY OF OXIDOREDUCTASES IN THE BLOOD OF RATS

Соловьева А.Г.

ORCID: 0000-0001-6890-4530, Кандидат биологических наук, Приволжский Федеральный медицинский исследовательский центр

ВОЗДЕЙСТВИЕ ДЛИТЕЛЬНОГО КУРСА ИНГАЛЯЦИЙ СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА НА АКТИВНОСТЬ ОКСИДОРЕДУКТАЗ В КРОВИ КРЫС

Аннотация

Исследована активность оксидоредуктаз крови животных при субхроническом воздействии газообразной смеси, содержащей синглетный кислород. Эксперимент проведен на крысах линии Wistar. В эритроцитах крови определяли активность ферментов через 30 и 60 суток после ингаляций синглетного кислорода. Показано, что применение на протяжении 30 суток синглетного кислорода, вызывает повышение детоксикационной функции, антиоксидантных резервов эритроцитов, снижение коэффициента баланса энергетических реакций. Отдаленные результаты (60 суток) использования синглетного кислорода свидетельствуют о нарушении энергетического метаболизма крови на фоне нормализации активности альдегиддегидрогеназы, повышения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов.

Ключевые слова: синглетный кислород, кровь, оксидоредуктазы.

Soloveva A.G.

ORCID: 0000-0001-6890-4530, PhD in Biology, Volga Federal Research Medical Centre

THE IMPACT OF SINGLET OXYGEN INHALATION ON THE ACTIVITY OF OXIDOREDUCTASES IN THE BLOOD OF RATS

Abstract

The activity of oxidoreductases of blood of animals following subchronic exposure of gaseous mixtures containing singlet oxygen were investigated. The experiment was carried out on Wistar rats. The activity of enzymes was determined in erythrocytes of blood by 30 and 60 days after inhalation of singlet oxygen. It was shown that application within 30 days of singlet oxygen causes in the increase of detoxification functions, antioxidant reserve of erythrocytes, decrease of the coefficient of energy reaction balance. Long-term (60 days) results of the use of singlet oxygen indicate about the violation of the energy metabolism of  blood on the background of normalization of activity of aldehyde dehydrogenase, increase of activity of catalase and superoxide dismutase of erythrocytes.

Keywords: singlet oxygen, blood, oxidoreductase.

В настоящее время при лечении хронического обструктивного бронхита, бронхиальной астмы, сахарного диабета и ряда других заболеваний эффективно используется синглетно-кислородная терапия, основанная на применении синглетно-кислородных смесей [1]. Применение синглетного кислорода (СК) нормализует углеводный и белковый обмен, стимулирует регенеративные процессы в тканях, снижает признаки гипоксии, восстанавливает антиоксидантное состояние и повышает детоксикационную функцию организма [1]. В то же время СК играет ключевую роль при развитии ряда патологических процессов [2, 3, 4], что обусловлено, вероятно, интенсификацией свободнорадикального окисления, активацией процессов перекисного окисления липидов биологических мембран. Усиленная продукция активных форм кислорода, в том числе, СК, вызывает окислительный стресс [5]. В этой связи актуальна проблема изучения активности окислительно-восстановительных ферментов при ингаляционно-наружном использовании газовой смеси, содержащей СК в условиях ее хронического воздействия на организм млекопитающих.

Целью исследования явилось изучение активности оксидоредуктаз в крови экспериментальных животных, подвергнутых субхроническому ингаляционно-наружному воздействию газовой смеси, содержащей СК.

Материалы и методы. Эксперимент проведен на белых крысах-самцах линии Wistar, полученных из филиала «Столбовая» ФГБУ «Научного центра биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» (Москва). Все животные содержались в стандартных условиях вивария в клетках при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, согласно нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ». Условия работы с животными соответствовали правилам Европейской Конвенции ET/S 129, 1986 и директивам 86/609 ESC. Из 19 крыс массой 200-250 г. сформировали 3 группы: 1 – контроль (интактные здоровые животные, n=8); 2 – опытная (n=6), в которой крысы были подвергнуты ежедневному воздействию (по 10 минут) газовой смеси, содержащей СК, в течение 30 дней; 3 – опытная (n=5), животные которой 30 суток ежедневно ингалировались по 10 минут газовой смесью с СК, и затем 30 суток не подвергались никаким манипуляциям. Крыс 2-ой группы выводили из эксперимента на 30-е сутки, 3-ей группы – на 60-е сутки путем декапитации под комбинированным наркозом (Золетил (60 мг/кг) + Ксила (6 мг/кг)). Ингаляционно-наружное воздействие СК на животных осуществляли в эксикаторе. Воздушный поток с СК получали с применением аппарата «Airnergy» (Германия) при мощности генератора 100%.

В гемолизате отмытых эритроцитов определяли активность супероксиддисмутазы (СОД) [6], каталазы [7], альдегиддегидрогеназы (АлДГ) [8] и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Активность ЛДГ в прямой реакции (ЛДГпр) оценивали с использованием в качестве субстрата 50 мМ лактат натрия, в обратной реакции (ЛДГобр) – с 23 мМ пируват натрия [9]. Концентрацию белка определяли по методу Лоури в модификации [10]. Для выявления нарушений энергетического метаболизма рассчитывали коэффициент баланса энергетических реакций (КБЭР): КБЭР = (ЛДГпр/ЛДГобр) / (ЛДГобр/ЛДГпр) × 100 [9]. Активность оксидоредуктаз, количество белка определяли на спектрофотометре Power Wave XS (Bio-Tek, USA). Результаты обрабатывали с использованием Statistica 6.0. Значимость различий между показателями определялась с помощью t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми считались различия при р<0,05.

Результаты и обсуждение. Исследование ЛДГ (КФ 1.1.1.27) выявило снижение удельной активности ЛДГпр под воздействием газообразной смеси, содержащей СК, во 2-ой и 3-ей опытных группах на 32% (р=0,022) и 50% (р=0,009) соответственно по сравнению с интактными животными (таблица). Под влиянием СК удельная активность ЛДГобр возросла во 2-ой и 3-ей группах на 40% (р=0,012) и 58% (р=0,010) по сравнению с контролем, что может привести к росту уровня лактата в эритроцитах.

Таблица 1 – Активность оксидоредуктаз в эритроцитах крови крыс при субхроническом воздействии синглетного кислорода

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0,05); ** - различия статистически значимы по сравнению с 30 сутками (p<0,05).

Установлено, что через 30 и 60 суток после воздействия газовой смеси, содержащей СК, КБЭР, характеризующий динамику метаболизма, оказался ниже показателя КБЭР здоровых крыс в 5,27 раза (р=0,005)  и 10,04 раза (р=0,001), что свидетельствует о нарушении энергетического метаболизма и как следствие увеличении содержания молочной кислоты в эритроцитах.

Восстановление пирувата в лактат сопровождается одновременным окислением алкоголя в ацетальдегид при помощи НАДН, который действует как интермедиарный переносчик водорода. Во 2-ой опытной группе выявлено увеличение удельной активности одного из ферментов детоксикации, АлДГ (КФ 1.2.1.3.) на 64% (р=0,021) по сравнению с контролем (таблица). Через 60 суток после применения газообразной смеси, содержащей СК, активность АлДГ уменьшилась на 46% по сравнению с показателем 2-ой опытной группы, что способствует накоплению альдегидов, оказывающих  повреждающее действие на ткани путем связывания с каталитическими центрами ферментов, следствием чего является нарушение метаболизма клетки. Падение каталитических свойств АлДГ может привести к срыву всей системы детоксикации, вызывая уменьшение защиты эритроцитов от окислительного действия эндотоксинов [11].

Известно, что увеличение альдегидов происходит также вследствие повышения активности фермента антиоксидантной защиты каталазы (КФ 1.11.1.6.), участвующего в окислении спиртов и защищающего клеточные мембраны от повреждающего действия свободных радикалов. Показано повышение активности каталазы на 27% (p=0,012) через 30 суток и на 74% (p=0,001) через 60 суток после воздействия СК по сравнению с контролем, и на 36% (р=0,017)  по сравнению с показателем крыс 2-ой опытной группы, что  обеспечивает эффективную защиту клеточных структур от перекиси водорода, но может привести к накоплению высокотоксичных метаболитов. Повышение активности каталазы под влиянием СК может свидетельствовать о положительных изменениях антиоксидантных ресурсов эритроцитов.

Исследование каталитических свойств фермента первой линии антиоксидантной защиты выявило уменьшение удельной активности СОД (КФ 1.15.1.1) на 7% (р=0,058) через 30 суток после воздействия СК по сравнению с контролем. В восстановительном периоде спустя 60 суток после ингаляционно-наружного применения СК отмечено повышение удельной активности СОД. В третьей опытной группе активность СОД возросла на 24% (р=0,033) и 34% (р=0,002) по сравнению с контролем и показателем 2-ой опытной группы соответственно. Таким образом, через 60 суток после ингаляционно-наружного применения синглетного кислорода отмечено повышение энзиматической антиоксидантной активности в эритроцитах. Это создавало условия для обрыва процессов перекисного окисления  липидов.

Заключение. Таким образом, показано, что длительное воздействие на протяжении 30 суток газовой смеси, содержащей СК, вызывает, с одной стороны, повышение детоксикационной функции крови и антиоксидантных резервов эритроцитов, с другой стороны, приводит к нарушению энергетического метаболизма, снижая показатель КБЭР. Отдаленные результаты (60 суток) ингаляционно-наружного применения газовой смеси, содержащей СК, свидетельствуют о нарушении энергетического метаболизма крови на фоне нормализации удельной активности АлДГ и повышении каталитических свойств каталазы и СОД эритроцитов.

Литература

1. Синглетно-кислородная терапия (научно-методическое пособие) / Под ред. Самосюк И. З., Фисенко Л. И. Киев: НМЦ «Мединтех», 2007. 228 с.
2. Dufour Y. S., Landick R., Donohue T. J. Organization and Evolution of the Biological Response to Singlet Oxygen Stress // J Mol Biol. – 2008.  – Vol. 383, № 3. – P. 713-730.
3. Riethmuller M., Burger N., Bauer G. Singlet oxygen treatment of tumor cells triggers extracellular singlet oxygen generation, catalase inactivation and reactivation of intercellular apoptosis-inducing signaling // Redox Biol. – 2015. – № 6. – P. 157-168.
4. Tarpy S. P., Celli B. R. Long-term oxygen therapy // Engl J Med. – 1995. – Vol. 333, № 11. –  Р. 710–714.
5. Меньщикова Е. Б., Зенков Н. К., Ланкин В. З., Бондарь И. А., Труфакин В. А. Окислительный стресс. Патологические состояния и заболевания. Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2008. 284 с.
6. Сирота Т. В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. – 1999. – Т. 45, № 3. – С. 109–116.
7. Сибгатуллина Г. В., Хаертдинова Л. Р., Гумерова Е. А. Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений (учебно-методическое пособие). Казань: Казанский (Приволжский) Федеральный университет, 2011. 61 с.
8. Кершенгольц Б. М., Ильина Л. П. Биологические аспекты алкогольных патологий и наркоманий. Якутск: Изд-во ЯГУ, 1998. 150 с.
9. Соловьева А. Г., Зимин Ю. В. Новый способ оценки динамики метаболизма крови у больных с термической травмой // Современные технологии в медицине. – 2012. – № 2. – С. 116-117.
10. Waterborg J. H., Matthews H. R. The Lowry method for protein quantitation // Methods Mol Biol. – 1994. – Vol. 32, №1. – P. 1-4.
11. Соловьева А. Г. Роль альдегиддегидрогеназы печени и эритроцитов в развитии ожоговой токсемии у крыс // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2009. – № 9. – С. 36-38.

References

1. Singletno-kislorodnaja terapija (nauchno-metodicheskoe posobie) / Pod red. Samosjuk I. Z., Fisenko L. I. Kiev: NMC «Medinteh», 2007. 228 s.
2. Dufour Y. S., Landick R., Donohue T. J. Organization and Evolution of the Biological Response to Singlet Oxygen Stress // J Mol Biol. – 2008.  – Vol. 383, № 3. – P. 713-730.
3. Riethmuller M., Burger N., Bauer G. Singlet oxygen treatment of tumor cells triggers extracellular singlet oxygen generation, catalase inactivation and reactivation of intercellular apoptosis-inducing signaling // Redox Biol. – 2015. – № 6. – P. 157-168.
4. Tarpy S. P., Celli B. R. Long-term oxygen therapy // Engl J Med. – 1995. – Vol. 333, № 11. –  Р. 710–714.
5. Men'shhikova E. B., Zenkov N. K., Lankin V. Z., Bondar' I. A., Trufakin V. A. Okislitel'nyj stress. Patologicheskie sostojanija i zabolevanija. Novosibirsk: Sibirskoe universitetskoe izdatel'stvo, 2008. 284 s.
6. Sirota T. V. Novyj podhod v issledovanii processa autookislenija adrenalina i ispol'zovanie ego dlja izmerenija aktivnosti superoksiddismutazy // Voprosy medicinskoj himii. – 1999. – T. 45, № 3. – S. 109–116.
7. Sibgatullina G. V., Haertdinova L. R., Gumerova E. A. Metody opredelenija redoks-statusa kul'tiviruemyh kletok rastenij (uchebno-metodicheskoe posobie). Kazan': Kazanskij (Privolzhskij) Federal'nyj universitet, 2011. 61 s.
8. Kershengol'c B. M., Il'ina L. P. Biologicheskie aspekty alkogol'nyh patologij i narkomanij. Jakutsk: Izdatel'stvo JaGU, 1998. 150 s.
9. Soloveva A. G., Zimin Ju. V. Novyj sposob ocenki dinamiki metabolizma krovi u bol'nyh s termicheskoj travmoj // Sovremennye tehnologii v medicine. – 2012. – № 2. – S. 116-117.
10. Waterborg J. H., Matthews H. R. The Lowry method for protein quantitation // Methods Mol Biol. – 1994. – Vol. 32, №1. – P. 1-4.
11. Soloveva A. G. Rol' al'degiddegidrogenazy pecheni i jeritrocitov v razvitii ozhogovoj toksemii u krys // Vestnik Rossijskoj akademii medicinskih nauk. – 2009. – № 9. – S. 36-38.