ASSESSMENT OF TOLERANCE OF P. FUSARIUM AND R. PENICILLIUM FUNGI TO HEAVY METALS (Pb, Cd)
ASSESSMENT OF TOLERANCE OF P. FUSARIUM AND R. PENICILLIUM FUNGI TO HEAVY METALS (Pb, Cd)
Abstract
One of the most important ways to prevent soil degradation is early diagnosis of negative changes, therefore, it is important to search for adequate test facilities for agroecological monitoring. In this work, tolerance to various concentrations of lead salt was assessed (0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0312 g/l), cadmium (0.25, 0.125, 0.0625, 0.0312, 0.0150 g/l) isolates of P. Fusarium fungi isolated from the soybean rhizosphere (Glycine max) and R. Penicillium isolated from soybean seeds grown in the forest-steppe zone of the Krasnoyarsk Territory. The paired t-test, the Wilcoxon test and the sign test showed that Fusarium sp. It is statistically significantly (p<0.05) more sensitive to the presence of cadmium than Penicillium sp, in other variants of the study, paired tests did not reveal statistically significant differences. This is due to the complex nonlinear nature of the corresponding dose-effect curves. The tolerance of R. Fusarium and R. Penicillium to heavy metals is characterized through the equations of dependence of the dose of the toxicant and the proportion of dead conidia (in %). It was found that for the biodiagnosis of contamination with lead ions (0.25-1.0 mg/l) and cadmium (0.125-0.5 mg/l), it is possible to use conidium Penicillium sp., in these ranges, the dependence of the proportion of dead conidia is adequately approximated by an exponential function.
1. Введение
Ингредиентное загрязнение – это одно из опасных антропогенных воздействий на агроэкосистемы, особенно на важный компонент – почвенную среду. Тяжелые металлы являются приоритетными загрязнителями, негативно влияющие на все биотические компоненты агроэкосистемы.
Основными источниками загрязнения тяжелыми металлами почв сельскохозяйственного назначения являются минеральные удобрения, пестициды, несанкционированные свалки отходов и другие.
Для оценки воздействия влияния антропогенной нагрузки на экосистемы широко используется метод биотестирования , в том числе и в наших работах с помощью стандартных тест-объектов дана оценка экологического состояния земель сельскохозяйственного назначения Красноярского края . Преимущества биологических методов заключается в том, что живые организмы более чувствительны, чем используемые приборы, улавливают более низкие концентрации веществ . В качестве тест-видов для оценки токсичности почв, рекомендованных в стандартных методиках, в настоящее время используют в основном растения и животных (ракообразные, простейшие, кольчатые черви и др.) , .
Грибы являются интересным объектом для биомониторинга. В настоящее время накоплен большой материал о степени реагировании грибов на изменения окружающей среды , . Известно, что грибы обладают сорбционной способностью по отношению к тяжелым металлам и относительно к ним устойчивы , , , , . В небольших количествах многие металлы необходимы для жизнедеятельности грибов (Cu, Mn, Zn, Co, Sn, V, Ni, Cr и др.), однако в больших количествах становятся токсичными. Ряд металлов высокотоксичны и в малых количествах (Cd, Sb, As, Hg, Pb, Ag и др.) , . По литературным данным влияние токсического эффекта тяжелых металлов на микромицеты разнообразно. При выращивании различных грибов на питательных средах в присутствии металлов наблюдалось подавления роста и развитие мицелия, роста колоний, уменьшение спорообразования и изменение морфологии спор, изменение состава продуцируемых экзометаболитов , , , .
Такая способность микромицетов дает возможность поиска новых видов биоиндикаторов для оценки почв загрязненными тяжелыми металлами. Подбор чувствительных тест-объектов, которые адекватно характеризовали бы техногенную нагрузку на природную окружающую среду, актуальна несколько десятилетий. Грибы р. Fusarium и р. Penicillium в качестве объектов исследования выбраны ввиду их широкого распространения в окружающей среде и апробации другими исследователями в отношении Ni, Co, Fe, Mg и Mn , , .
Целью настоящего исследования является изучение чувствительности грибов р. Fusarium и р. Penicillium к различным концентрациям солей свинца и кадмия.
2. Объекты и методы
В качестве тест-культур в работе использованы изоляты грибов р. Fusarium, выделенные с ризосферы сои (Glycine max) и р. Penicillium, выделенные с семян сои, выращенной в лесостепной зоне Красноярского края.
Для определения чувствительности конидий грибов к различным концентрациям металлов смешивали питательную среду в чашках Петри с маточным раствором соли кадмия (сульфат кадмия, безводный, 99+%) для получения следующих концентраций раствора в среде, г/л: 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0,0150; соли свинца (свинца (II) сульфат, 99.5% (хч)), г/л: 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312. Конидии наносили на поверхность агаризованной среды.
Питательную среду Чапека-Докса, в которую добавляли кадмий, готовили в соответствии с инструкцией производителя: сахароза – 20,0 г/л; нитрат натрия – 2,0 г/л; фосфат калия двузамещенный – 1,0 г/л; сульфат магния – 0,5 г/л; хлорид калия – 0,5 г/л; сульфат железа – 0,01 г/л; агар – 20,0 г/л; рН 7,3±0,2. Чтобы ионы свинца не вступали в ионообменную реакцию с компонентами среды Чапека-Докса и не выпадали в осадок, был подобран следующий состав среды: глюкоза - 20,0 г/л, пептон – 10 г/л, агар-агар микробиологический – 14 г/л.
Чашки инкубировали в течение 20 часов при температуре 26 ºС. Учет жизнеспособности производили прямым методом, по количеству проросших и не проросших конидий грибов. Контролем служили конидии пророщенные на питательной среде без добавления металлов, прорастание конидий составляло 100%.
Для учета результатов эксперимента использовали микроскоп Микмед 6 вар. 7. с цифровой камерой DCM-130M. Анализ данных производили с использованием следующего программного обеспечения: пакет StatSoft STATISTICA 8.0. Статистическую значимость различий между вариантами с тяжёлыми металлами и контролем по прорастанию конидий проверяли точным тестом Фишера для таблиц 2х2. Подбор уравнений регрессии, описывающих зависимость доли погибших конидий от концентрации тяжёлых металлов, осуществляли с помощью модуля «Пользовательская регрессия» (User-specified regression) с использованием метода наименьших квадратов.
3. Результаты и их обсуждение
В контрольных вариантах прорастание конидий как Fusarium sp., так и Penicillium sp. составило 100 %. Статистически значимое снижение прорастания конидий Fusarium sp. отмечено в присутствии 0,0625 мг/л Pb, 0,5 мг/л Pb, 1 мг/л Pb и 2 мг/л Pb, а также в присутствии 0,015 мг/л Cd, 0,0312 мг/л Cd, 0,125 мг/л Cd, 0,25 мг/л Cd и 0,5 мг/л Cd (табл. 1).
Таблица 1 - Влияние тяжёлых металлов на прорастание конидий Fusarium sp.
Примечание: «нет» означает отсутствие статистически значимых различий
Таблица 2 - Влияние тяжёлых металлов на прорастание конидий Penicillium sp.
Примечание: «нет» означает отсутствие статистически значимых различий
Рисунок 1 - Прорастание конидий Penicillium sp.
Примечание: А – контроль; Б – ионы кадмия в дозе 0,5 мг/л
Уравнение, описывающее зависимость гибели конидий Fusarium sp. от концентрации Pb, имеет вид:
Уравнение, описывающее зависимость гибели конидий Fusarium sp. от концентрации Cd, имеет вид:
Уравнение, описывающее зависимость гибели конидий Penicillium sp. от концентрации Pb, имеет вид:
Уравнение, описывающее зависимость гибели конидий Penicillium sp. от концентрации Cd, имеет вид:
где:
X – концентрация тяжёлого металла (мг/мл),
Y – доля погибших конидий (%),
a1, a2, a3, a4 и a5 – коэффициенты.
Статистическая значимость всех регрессионных моделей p<0,001. Коэффициент детерминации для модели (1) R2=0,99998, для модели (2) R2= 0,98290, для модели (3) R2= 0,99945, для модели (4) R2= 0, 99958. Экспериментальные и теоретические (рассчитанные по соответствующим уравнениям) значения доли погибших конидий при разных концентрациях тяжёлых металлов показаны на рисунках 2–5.
Рисунок 2 - Влияние Pb на жизнеспособность конидий Fusarium sp.
Рисунок 3 - Влияние Cd на жизнеспособность конидий Fusarium sp.
Рисунок 4 - Влияние Pb на жизнеспособность конидий Penicillium sp.
Рисунок 5 - Влияние Cd на жизнеспособность конидий Penicillium sp.
Рисунок 6 - Кривая «доза-эффект» как сумма двух дозовых кривых на примере влияния Pb на жизнеспособность конидий Penicillium sp.
Примечание: f1 – график первой функции в уравнении (3); f2 – график второй функции в уравнении (3) (А); f1+f2 – сумма f1 и f2 (уравнение (3)) (Б)
С практической точки зрения можно рекомендовать использование конидий Penicillium sp. для биотестирования Pb в диапазоне концентраций 0,25-1,0 мг/л и Cd в диапазоне концентраций 0,125-0,5 мг/л. В этом диапазоне зависимость доли погибших конидий адекватно аппроксимируется экспоненциальной функцией.
4. Заключение
В условиях лабораторного опыта, при модельном загрязнении среды ионами тяжелых металлов выявлено токсическое воздействие на грибы р. Fusarium и р. Penicillium к различным концентрациям солей свинца и кадмия. Обнаружено, что к присутствию в среде ионов кадмия Fusarium sp. статистически значимо (p<0,05) более чувствителен, чем Penicillium sp.
В качестве тест-объектов можно рекомендовать использование конидий Penicillium sp. для биотестирования токсичности: ионов свинца в диапазоне концентраций 0,25-1,0 мг/л, ионов кадмия в диапазоне концентраций 0,125-0,5 мг/л.