ANTIGENIC STRUCTURE OF THE HAEMAGGLUTININ OF INFLUENZA VIRUS V/MASSACHUSETTS/02/2012

Вирусы гриппа вызывают ежегодные эпидемии глобального масштаба, которые являются причиной роста смертности в мире, представляя собой серьезную проблему для общественного здравоохранения. Большинство научных исследований посвящено главным образом вирусам гриппа А, тогда как знания об антигенной структуре поверхностных и внутренних антигенов вирусов гриппа В по-прежнему достаточно ограничены

В связи с вышеизложенным мониторинг изменений антигенной структуры поверхностного белка гемагглютинина вирусов гриппа В, и рецептор-связывающих характеристик вируса остаются актуальными задачами, имеющими как научную, так и важную с практической точки зрения значимость. Использование в современной вирусологии вируснейтрализующих моноклональных антител (моноАТ), которые направлены к конкретным иммуногенным сайтам поверхностного антигена, а также, методологии отбора и изучения эскейп-мутантов (ЭМ), позволяет мониторировать возникновение новых генетических/антигенных модификаций вирусов.

Вирусы гриппа В получены из коллекции вирусов гриппа и ОРВИ ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.

Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости

Вирусы гриппа культивировали в аллантоисной полости развивающихся куриных эмбрионов согласно Методическим рекомендациям «Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация» (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 18 апреля 2006 г. No 0100/4430-06-34). Для получения аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа, 10-11-дневные куриные эмбрионы заражали вирусом гриппа В в дозе от 10 до 100 ЭИД50/0,2 мл, инкубировали 72 часа при температуре 33 ± 0,50 С. Затем эмбрионы охлаждали при температуре +40 С и аллантоисную жидкость, содержащую вирус, собирали и контролировали гемагглютинирующую активность.

Реакция гемагглютинации (РГА), реакция торможение гемагглютинации (РТГА)

РГА и РТГА проводили в соответствии с Методическими рекомендациями «Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация» (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 18 апреля 2006 г. No 0100/4430-06-34)

Получение гибридом

Гибридомы – продуценты моноАТ к штамму вируса гриппа В/Массачусетс/2/12 Ямагатской линии получали по методу

Получение эскейп-мутантов

Для отбора ЭМ, штаммы исходного вируса клонировали в присутствии избытка отобранных моноАТ, обладающих выраженной вируснейтрализующей активностью

Секвенирование эскейп-мутантов

Для секвенирования гена НА ЭМ вируса гриппа В/Массачусетс/2/12 РНК выделяли коммерческим набором RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия).

RT-ПЦР. Для амплификации фрагментов гена гемагглютинина применяли набор реагентов AgPath-ID One-step RT-PCR Kit (Ambion, США). Анализ апликонов проводили гель-электрофорезом в 1,7% агарозном геле. Фотосъемка осуществлялась системой мультиплексной визуализации ChemiDoc MP Imaging System (BioRad, США).

Для выделения ДНК ампликонов использовали два метода: набором PCR Purification kit (Quiagen, Германия) или выделяли с помощью DEAE бумаги. Концентрацию ДНК после выделения определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (Thermo, США).

Для секвенирования методом Сэнгера применяли коммерческий набор реагентов ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). В состав реакционной смеси входили: BigDye Terminator – 1 мкл, 5X Sequencing Buffer – 4 мкл, праймер – 1 мкл, ДНК (из расчета 50 нг ДНК в конечном объеме смеси – 10 мкл) – 5 мкл. Конечный объем смеси – 10 мкл. Для увеличения глубины секвенирования каждая реакция была поставлена в двух повторах. Программа секвенирующей реакции: 96oС – 10 сек, 50oС – 5 сек, 60oС – 4 мин (25 циклов). Реакцию секвенирования проводили в термоциклере BioRad CFX96 Real-Time System C100 Thermal Cycler (BioRad, США). Для определения нуклеотидной последовательности использовали 4-канальную автоматизированную систему капиллярного электрофореза и флуоресцентной детекции ДНК-фрагментов ABI prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Для капиллярного электрофореза использовали полимеры ABI prism3130 POP-7.

Сборка, хранение и обработка полученных нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей осуществлялись в программе Vector NTI 10 Advance (Invitrogen, США). Для множественного выравнивания полученных нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями ГА референсного штамма использовали программу Vector NTI 10 Advance и алгоритм CLUSTAL W.

Характеристика моноАТ к вирусу гриппа В/Массачусетс/2/12 в РТГА

РТГА основана на способности антител ингибировать взаимодействие гемагглютинина с эритроцитарными рецепторами. Значимость данной реакции заключается в возможности оценки уровня взаимодействия моноАТ с антигенными сайтами прежде всего в районе «рецепторного кармана» гемагглютинина. «Рецепторный карман» является исключительной мишенью для вируснейтрализующих моноАТ, блокирующих взаимодействие вируса с клеточным рецептором. Рецепторная область представляет собой вариабельную часть молекулы гемагглютинина, претерпевающую наибольшие изменения в процессе эволюции вируса в результате антигенного дрейфа. Благодаря этому вирус ускользает от действия вируснейтрализующих антител. Взаимодействие моноАТ с гемагглютинином отобранных штаммов в РТГА позволяет оценить антигенные штаммовые различия в рецепторной области, что имеет большое и практическое, и теоретическое значение. МоноАТ к штамму В/Массачусетс/2/12 (Ямагата) проявляли выраженную антигемагглютинирующей активностью исключительно к вирусам, относящимся к этой эволюционной ветви (табл. 1). 

Следует подчеркнуть, что все моноАТ взаимодействовали со штаммами выделенными, начиная с B/Ямагата/16/88, а также со штаммами, относящимися к генетическим группам 1 (B/Флорида/04/06) и 3 (B/Пхукет/3073/13), которые наиболее широко распространены в мире

Отбор ЭМ вируса B/Массачусетс/2/12 c помощью моноАТ

В результате проведенных исследований подтверждено, что эскейп-мутанты, полученные с помощью вируснейтрализующих моноАТ, стали незаменимым инструментом для мониторинга изменчивости антигенной структуры ГА и поиска иммунодоминантных эпитопов в структуре ГА1. Установлено, что полученные ЭМ содержали до трех мутаций в гене ГА, которые приводили к специфичным аминокислотным заменам. При этом в РТГА с ЭМ наблюдали 8-32-х-кратное и более снижение титров моноАТ, которые использовали для отбора ЭМ по сравнению с исходным вирусом. Таким образом, было получено 16 ЭМ, устойчивых к действию каждого из моноАТ, в частности, было получено по два ЭМ под действием моноАТ 2B10, 3B12, 3C2, 1G4, 1G9 и 4E11, три – моноАТ 5B11 и один – моноАТ 5F11.

Выявление иммунодоминантных эпитопов в молекуле гемагглютинина вируса B/Массачусетс/2/12

Для выявления иммунодоминантных эпитопов было проведено секвенирование ГА ЭМ вируса B/Массачусетс/2/12. Анализ предсказанной структуры ГА ЭМ вируса B/Массачусетс/2/12 в сравнении со структурой ГА исходного вируса позволил выявить замены аминокислот в шести положениях. Более того, все замены были расположены в районе рецептор-связывающего сайта (РСС) ГА, и касались петель–140, –240, и спирали–190. Исследование двух ЭМ, для моноАТ 1G9, позволил установить, что ЭМ 1G9/1 содержал две замены, в частности глицина на глютаминовую кислоту в положении 141 (Gly→Glu) и глицина на аргинин в положении 237 (Gly→Arg). Аминокислотная замена глицина на глютаминовую кислоту в 141 положении (Gly→Glu) была выявлена также у ЭМ 2B10/1, 2B10/2, 3C2/1, 3C2/2, 1G4/1, 1G4/2. ЭМ 1G9/2 содержал единственную замену 237 Gly→Arg. Выявлено, что ЭМ 3B12/1, отобранный с помощью моноАТ 3B12, содержал единственную замену пролина на глютамин в 240 положении, а ЭМ 3B12/2 0150 две замены - Pro на Gln в 240 и Asn на Lys в 202 положениях, соответственно. Остаток-240 ГА1, по-видимому является частью антигенного сайта, который частично совпадает с антигенным сайтом D ГA штаммов гриппа А субтипа H3

Следует отметить, что замена-136 имеет важное значение в структуре РСС - остаток Arg в 136 положении обнаружен у 98% вирусов Ямагатской ветви и только у 1% вирусов Викторианской ветви, а штаммы 1972-1982 годов выделения имеют остаток изолейцина

В результате пассирования под давлением моноАТ 5F11 был получен только один ЭМ, который имел две замены: в 136 положении Arg→Ile и в 196 положении Asp→Gly. Выше отмечалось, что изменения в 136 положении в петле-140, значимо для формирования структуры рецептор-связывающего сайта. Замена остатка - 196 входящего в спираль -190, влияет на формирование верхней кромки рецептор-связывающего кармана (РСК) ГА вирусов гриппа В. Кроме того, набор остатков-196 на участке 196-198 определяет наличие/отсутствие потенциального сайта N–гликозилирования. ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 содержали единственную замену Asn 202 Lys, которая располагается в спирале -190 и участвует в образовании РСК. Расположение всех выявленных аминокислотных замен в ГA ЭМ B/ Массачусетс /2/12 представлено на рис. 1.

Рисунок 1 - Расположение аминокислотных замен в молекуле НА1 эскейп-мутантов вируса B/ Массачусетс /2/12

Примечание: А – вид сбоку, Б – вид сверху

DOI:10.23670/IRJ.2023.138.217.2

На рисунке показано расположение иммунодоминантных эпитопов на пространственной трехмерной модели молекулы ГА1, которая построена на основе идентифицированных эпитопов в ЭМ и опубликованных данных по кристаллической структуре молекулы ГА вируса гриппа B/Яманаши/166/98, PDB code: 4М40

[33]

, с помощью программы RasMol, версия 2.7.4.2. А – вид сбоку, Б – вид сверху.

На основании представленных данных можно сделать заключение, что идентифицированные в ходе исследования замены вовлечены в формирование ГА вируса B/Массачусетс/2/12 и влияют на способность связываться с моноАТ.

Влияние замен аминокислотных остатков в молекуле ГА ЭМ вирусов гриппа B/Массачусетс/2/12 на характер взаимодействия с моноАТ

Для оценки влияния замен на характер взаимодействия вируса с моноАТ, было изучено их взаимодействие с ЭМ в перекрестной РТГА (табл. 2). Согласно полученным результатам, все ЭМ слабо реагировали с гомологичными моноАТ, с помощью которых они были получены. В этом случае титры моноАТ варьировали от 1/64 в случае моноАТ 1G4 до 1/2048 в случае моноАТ 5F11.

МоноАТ 1G4, 2В10 и 3С2, узнающие эпитоп в 141 положении, показали значительное снижение титров со всеми ЭМ, несущими замену 141Gly→Glu. В тоже время, моноАТ 1G4 также имели заметное снижение титра до 1/32 при взаимодействии с ЭМ 1G9/2, несущим замену Gly→Arg в 237 положении; ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 с заменой Asn→Lys в положении 202 до 1/64 титра; ЭМ 3В12/2, содержащий замены Asn→Lys в 202 и Pro→Gln в 240 положении до 1/256 титра. Не выявлено существенного снижения титра при взаимодействии с ЭМ 3В12/1 с единичной заменой Pro→Gln в 240 положении (1/4 титра). МоноАТ 1G4 реагировали с ЭМ 5В11/1 и 5В11/3, содержащими замены Arg 136 Ile и Pro 240 Ser, и с ЭМ 5F11, содержащим замены Arg 136 Ile и Asp 196 Gly, как и с исходным вирусом (1-1/2 тира). Таким образом, установлено, что моноАТ 1G4 распознает эпитопы в положениях 141, 202 и 237.

МоноАТ 2В10 показали снижение взаимодействия до 1/16 титра с ЭМ 3В12/1(замена Pro→Gln в 240 положении) и 1/256 с ЭМ 3В12/2 (замены Asn→Lys и Pro→Gln в 202 и 240 положениях, соответственно). При этом моноАТ 2В10 взаимодействовали до 1/8 титра с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 (Asn 202 Lys). ЭМ 5В11/1 и 5В11/3 (Arg 136Ile и Pro 240 Ser) реагировали с моноАТ 2В10 до 1/4-1/8 титра. Можно предполагать, что замены в положениях 202 и 240, Asn → Lys и Pro → Gln, соответственно, особенно в совокупности, значимы для связывания с моноАТ 2В10.

МоноАТ 3С2, в отличии от моноАТ 2В10 и моноАТ 1G4, практически не потеряли способности взаимодействовать с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2, содержащими Lys-202, однако, резкое снижение титров наблюдали в реакции с ЭМ 3В12/1, содержащим замену Pro→Gln в 240 положении до 1/128 и ЭМ 3В12/2, содержащим Lys-202 и Gln-240 до 1/512 титра. Изменения Arg 136 Ile в, Pro 240 Ser и Asp 196 Gly не отразились на способности моноАТ взаимодействовать с ЭМ. Можно предположить, что в этом варианте, помимо эпитопа в 141 положении, в случае моноАТ 3С2 существенным моментом является конкретный остаток в 240 положении.

МоноАТ 1G9, распознающие замены в 141 и 237 положениях, слабо реагировали с ЭМ, имеющими замены в 141 и 237 положениях. МоноАТ 1G9 проявляли незначительное уменьшение титров взаимодействуя с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 (Asn 202Lys) до 1/4, до 1/8-1/16 с ЭМ 3В12/1 (Pro 240 Gln) и резкое падение титров с ЭМ 3В12/2 (остаток лизина и глютамина в 202 и 240 положениях). ЭМ 5В11/1 и 5В11/3 (остаток изолейцина и серина в 136 и 240 положениях, соответственно) связывались с моноАТ на 1/2 – 1/4 титра, а ЭМ 5F11 (остаток изолейцина-136 и глицина-196) взаимодействовал с моноАТ 1G9 подобно исходному вирусу.

МоноАТ 3В12 распознавали остатки аспарагина-202 и пролина-240. МоноАТ 3В12 проявляли одинаковый характер реагирования с ЭМ 1G4, 2В10 и 3С2 (Gln →Glu в 141 положении) до 1/2-1/4 титра. МоноАТ 3В12 одинаково взаимодействовали до 1/8 с ЭМ 1G9/2 (Gln →Arg в 237 положении) и ЭМ 1G9/2, имеющим две замены Gln 141 Glu и Gln 237 Arg. Аналогичное взаимодействие было с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 (Asn 202 Lys). При этом, моноАТ 3В12 взаимодействовали до 1/256 с ЭМ 3В12/1 (замена Pro→Gln в 240 положении) и полностью перестали реагировать с ЭМ 3В12/2 (замены Asn→Lys и Pro→Gln в 202 и 240 положениях, соответственно). Аналогично, моноАТ 3В12 утратили способность к связыванию с ЭМ 5В11/1 и 5В11/3 (замены Arg →Ile и Pro→Ser в 136 и 240 положениях, соответственно), ЭМ 5В11/2 (замены Arg →Ile и Gln →Glu в136 и 141 положениях, соответственно). Также моноАТ 3В12 практически полностью перестали реагировать с ЭМ 5F11 (замены Arg →Ile и Asp→Gly в 136 и 196 положениях, соответственно). Таким образом, вероятно, для моноАТ 3В12 наиболее значимыми являются остатки в 240 и 136 положениях, и в меньшей степени – аминокислотные остатки в 202 положении. Анализ ЭМ 4Е11 установил специфичность моноАТ 4Е11 к эпитопу в 202 положении. Действительно, моноАТ 4Е11 взаимодействовали с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2, содержащими замену Asn→Lys в 202 положении на 1/128 по сравнению с исходным вирусом. Произошла полная утрата способности взаимодействия с ЭМ 3В12/2, содержащим замены Asn→Lys в 202 и Pro→Gln в 240 положениях и значительная – до 1/16 титра с ЭМ 3В12/1 (замена Pro→Gln в 240 положении). Менее значительное снижение титров (на 1/8) произошло в реакции с ЭМ 5В11/2 (замены Arg→Ile в 136 и Gly→Glu в 141 положениях). МоноАТ 5В11, по данным секвенирования ЭМ, были специфичны к эпитопам в положениях 136, 240 и 141. Вызывает удивление тот факт, что моноАТ 5В11 взаимодействовали с ЭМ 1G4, 2В10 и 3С2, имеющими замену Gly→Glu в 141 положении, практически, как и с диким вирусом (отличия в РТГА не более 1/2). При этом, моноАТ 5В11 слабо реагировали с ЭМ 3В12/2 (замены Asn→Lys в 202 и Pro→Gln в 240 положениях), но почти до полного титра (на 1/2) с ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 (замену Asn→Lys в 202 положении) и ЭМ 3В12/1(замена Pro→Gln в 240 положении). Было отмечено существенное снижение титров с гомологичными ЭМ 5В11/1 и 5В11/3 (замены Arg→Ile в 136 и Pro →Ser в 240, положениях) и менее значимое с ЭМ 5В11/2 (замены Arg→Ile в 136 и Gly →Glu в 141 положениях). Титр моноАТ 5В11 с ЭМ 5F11 (замены Arg→Ile в 136 и Asp→Gly в 196 положениях) был всего 1/256 от исходного вируса. Незначительное снижение титров на 1/2-1/8 показали моноАТ 5F11 с ЭМ 1G9/1 и 1G9/2, которые содержали, замены Gly→Glu и Gly→Arg в 141 и 237 положениях, соответственно. При этом моноАТ 5F11 слабо реагировали с ЭМ 3В12/1 (замена Pro→Gln в 240 положении) и ЭМ 3В12/2 (замены Asn→Lys в 202 и Pro→Gln в 240 положениях). МоноАТ 5F11 очень слабо взаимодействовали с ЭМ 5В11/2 (замены Arg→Ile в 136 и Gly→Glu в 141, положениях) и гомологичным ЭМ 5F11 (Arg 136 Ile и Asp 196 Gly), с ЭМ 5В11/1 и 5В11/3 (Arg 136 Ile и Pro 240 Ser) взаимодействие отсутствовало полностью. Установлено, что ГА вируса гриппа В содержит четыре основные антигенные области: петли-120, -150 и -160, и спираль-190. Эти антигенные участки лежат в непосредственной близости или частично входят в структуру РСС, располагаясь близко в пространстве, и образуют большой протяженный антигенный сайт [34]. Это согласуется с нашими результатами, в случае, когда одно моноАТ распознает детерминанты, находящиеся в двух различных, но пространственно близких антигенных областях.

Анализ антигенной структуры ГА вирусов гриппа В Ямагатской эволюционной ветви имеет большое теоретическое, и практическое значение. В связи с этим, была поставлена цель провести эпитопное картирование молекулы ГА вирусов гриппа B/Massachusetts/2/12 с помощью моноклональных антител и идентифицировать аминокислотные замены, значимые при связывании с вируснейтрализующими антителами.

Селекция ЭМ вируса гриппа B/Massachusetts/2/12 стала возможной благодаря выраженной вируснейтрализующей активности разработанных моноАТ. Было получено 16 ЭМ, устойчивых к вируснейтрализующему действию каждого из используемых моноАТ, по два ЭМ в случае моноАТ 1G4, 1G9, 2B10, 3B12, 3C2 и 4E11, три ЭМ – моноАТ 5B11 – и один ЭМ – моноАТ 5F11.

В результате сравнительного анализа аминокислотных последовательностей ГА ЭМ и ГА исходного вируса установлены замены в шести положениях – 136 и 141 в петле 140, 237 и 240 в петле-240, 196 и 202 в спирале-190.

Оказалось, что большинство замен были расположены в районах, формирующих РСС вирусов гриппа В, а именно в петлях–140 –240 и в спирали–190. Известно, что РСС, находящийся в верхней части молекулы ГА, сформирован спиралью–190 (НА1 193-202) на вершине, петлей–240 (ГА1 237-242) – левая кромка, и петлей–140 (ГА1 136-143) – правый край. При этом четыре аминокислотные остатка в молекуле ГА1 (Phe-95, Trp-158, His-191 и Tyr-202), составляющие основу РСС, высоко консервативны у большинства вирусов гриппа В.

Нами показано, что ряд ЭМ, отобранных с помощью моноАТ 1G4, 2B10 и 3C2, содержали идентичную замену глицина на глютаминовую кислоту (Gly 141 Glu), расположенную в петле–140. В ряде работ было указано, что 141 положение в структуре ГА гриппа В достаточно вариабельно. Так, вирусы с заменой Gly→Val в 141 положении выявлялись еще до расхождения на две филогенетические ветви

Анализ двух ЭМ, полученных с использованием моноАТ 1G9, показал, что ЭМ 1G9/1 имел две аминокислотные замены глицина на глютаминовую кислоту (Gly → Glu) в 141 позиции и глицина на аргинин (Gly → Арг) в 237 позиции. ЭМ 1G9/2 содержал только замену Gly → Арг в 237 позиции. Примечательно, что обе замены располагаются РСК ГА, но при этом, находятся в двух различных районах - замена Gly → Glu в 141 позиции в петле-140, в тоже время, замена Gly → Арг в 237 позиции - в петле-240. Установлено, что присутствие остатка Gly-237 делает петлю-240 более протяженной, а единичная замена в донном положении обеспечивает переориентацию боковых цепей. Изменение ориентации боковых цепей в последовательности 235-240 ГА1 может кардинально изменять антигенные свойства этого региона (33 Ni F., et al., 2013). Так как, пространственно остатки Gly-237 и Gly-141 находятся близко, по-видимому, замена Gly→Arg в 237 позиции изменяет пространственную структуру таким образом, что это позволяет моноАТ 1G9 распознавать эпитоп в положении 141 ЭМ 1G9/1, имеющего замены Gly 141 Glu и Gly 237 Arg.

Установлено, что ЭМ 4Е11/1 и 4Е11/2 содержали единичную замену Asn 202 Lys. Ранее было обнаружено, что большая часть остатков, окружающих РСК ГА вируса гриппа В, одинаковы у штаммов Ямагатской и Викторианской ветвей, кроме нескольких положений: 163, 198, 202 и 203 (нумерация для вирусов гриппа Викторианской ветви); в случае наличия Asn – 163 потенциального сайта N-гликозилирования в ГА вирусов гриппа В Ямагатской ветви нет

Показано, что ЭМ 3B12/1 имел единичную замену пролина на глютамин в 240 положении, а ЭМ 3B12/2 содержал две замены Pro 240 Gln и Asn 202 Lys. Ранее замена Pro 240 Ser была обнаружена у ЭМ Викторианской ветви

Все остатки на наружной поверхности спирали–190 имеют значимую антигенную роль. Отдельные замены в этой области неоднократно встречались в ЭМ вирусов гриппа, селектированных с использованием моноАТ: Glu 195 Lys, Gln 197 Lys, Val → Ala, Leu или Glu в 199 пзициих

В результате проведенных исследований с помощью разработанных моноАТ, обладающих вируснейтрализующей активностью, получены 16 ЭМ эталонного штамма B/Массачусетс/2/12, резистентных к этим моноАТ. Сравнительный анализ предсказанных последовательностей ГА ЭМ B/Массачусетс/2/12 и исходного вируса позволил выявить в ГА1 вируса гриппа В Ямагатской ветви замены в 136 и 141 (петля-140), 196 и 202 (спираль-190) и 237, 240 (петля-240) положениях. Все выявленные аминокислотные замены расположены в участках, которые участвуют в формировании РСК ГА вируса гриппа В и оказывают влияние на антигенную специфичность ГА.