EFFECT OF HIGH-CALORIE DIET ON MORPHOFUNCTIONAL STATE OF THE LIVER AND STEARYL-COENZYME-A-DESATURASE LEVEL IN AN EXPERIMENT
EFFECT OF HIGH-CALORIE DIET ON MORPHOFUNCTIONAL STATE OF THE LIVER AND STEARYL-COENZYME-A-DESATURASE LEVEL IN AN EXPERIMENT
Abstract
The aim of this study was to examine the effect of a high-calorie diet on the morphofunctional state of the liver and the level of stearyl-coenzyme-A-desaturase in Wistar rats. For the experiment, 30 male rats were selected, from which two groups were formed: control (n=15) and experimental (n=15). Animals of the control group received the basic diet and animals of the experimental group received a high-calorie diet. The high-calorie diet for 12 weeks led to an increase in body weight, disturbance of carbohydrate and lipid metabolism, and development of fine fatty liver dystrophy in laboratory animals of the experimental group. There was a significant increase in the level of stearyl-coenzyme-A-desaturase in the liver of the experimental group relative to the control by 19.3%.
1. Введение
Исследования последних лет показывают, что во всем мире уже более 1,9 миллиарда взрослых людей имеют избыточный вес, 650 миллионов страдают ожирением , . По данным Международной федерации диабета установлено, что 451 миллион человек страдают сахарным диабетом 2 типа и ожидается, что к 2045 году эти цифры увеличатся до 693 миллионов. Насчитывается 374 миллиона человек с нарушением толерантности к глюкозе, у 21,3 миллиона женщин развивалась гипергликемия во время беременности . Одной из ключевых детерминант развития данных патологий является так называемый «западный тип питания», который характеризуется потреблением большого количества калорий . По данным J. Speakman, питание современного человека характеризуются беспрецедентно высоким уровнем потребления высококалорийной пищи .
При изучении механизмов возникновения ожирения и сахарного диабета 2 типа в последнее время исследователями акцентируется внимание на роли фермента стеарил-коэнзим-А-десатуразы (SCD, EC 1.14.19.1), являющегося ключевым в биосинтезе мононенасыщенных жирных кислот в большинстве тканей человека и грызунов, особенно в печени . Учитывая многочисленные роли данных жирных кислот, можно ожидать, что вариации уровня и активности SCD будут влиять на ряд ключевых физиологических процессов связанных с углеводным и липидным обменами. По данным ряда авторов SCD-1 представляет собой терапевтическую мишень для контроля ожирения и прогрессирования сопутствующих метаболических заболеваний , . В связи с этим целью данного исследования явилось изучение влияния высококалорийной диеты на морфофункциональное состояние печени и уровень SCD у крыс линии Wistar.
2. Методы и принципы исследования
Настоящее исследование выполнено на базе экспериментально-биологической клиники (вивария) ФГБНУ «Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий РАН». Эксперимент выполнен на крысах линии Wistar в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ 33044–2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики»). Для проведения эксперимента было отобрано 30 крыс-самцов в возрасте 5 месяцев с исходной массой тела 170-180 г, из которых были сформированы две группы: контрольная (n=15) и опытная (n=15). Животные контрольной группы получали основной рацион калорийностью 270 ккал/100 г (полнорационный корм, соответствующий ГОСТ-Р 50258-92), а животные опытной группы – высококалорийную диету. Сочетание большого количества углеводов и жиров разного происхождения более точно имитирует диету человека, в связи с этим высококалорийная диета основана на добавлении к основному рациону свиного сала, кокосового и подсолнечного масел, в качестве питья использовали 10% раствор фруктозы , . В ходе эксперимента калорийность диеты ступенчато увеличивалась на 30% (1-4 недели), 60% (5-8 недели) и 90% (9-12 недели) от калорийности основного рациона. Ступенчатую диету использовали с целью снижения стрессовой реакции организма при увеличении калорийности питания. По окончании 12 недель животные выводились из эксперимента для забора биоматериала. В рамках выполнения эксперимента проводилась регистрация морфометрических параметров (масса тела, масса печени, массовый коэффициент печени). Контрольные определения уровня глюкозы крови, общего холестерина, липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) и триглицеридов определяли с помощью биохимического экспресс-анализатора CardioChek (Polymer Technology System, США). На основании данных общего холестерина и ЛПВП рассчитывался коэффициент атерогенности. Пероральный глюкозотолерантный тест проводился путем внутрижелудочного введения 40% раствора глюкозы в дозе 2 г/кг и оценке уровня глюкозы через 30, 60, 90 и 120 минут . Для гистологического анализа после извлечения образцы ткани печени немедленно помещали в 10% забуференный формалин. Исследуемый материал фиксировали в течение суток в растворе молекулярного фиксатора, затем вырезали фрагменты печени и подвергали автоматической гистологической проводке, после чего изготавливались парафиновые блоки, с которых делали серийные срезы на ротационном микротоме Sakura Accu-Cut SRM200 (Япония). Нанесенные на предметное стекло срезы депарафинировали в ксилоле, обезвоживали в спиртах и окрашивали гематоксилином Майера и эозином по стандартному протоколу. Содержание SCD оценивалось в сыворотке крови и печени лабораторных животных методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора ELISA Kit for Stearoyl Coenzyme A Desaturase для количественного определения SCD в плазме/сыворотке крови, гомогенатах тканей и других биологических жидкостях крыс, этапы анализа соответствовали инструкции к набору. Обработку полученных данных проводили при помощи методов вариационной статистики с применением статистического пакета STATISTICA 10 (StatSoft Inc., США). Гипотеза о принадлежности данных нормальному распределению была отклонена во всех случаях с вероятностью 95%, что обосновало применение непараметрического U-критерия Манна-Уитни.
3. Результаты и их обсуждение
Результаты исследований показали, что ступенчатое увеличение калорийности рациона на протяжении 12 недель приводит к увеличению массы тела и печени, нарушению углеводного и липидного обменов (табл. 1).
Таблица 1 - Влияние высококалорийной диеты на морфометрические и биохимические показатели
Показатели | Контрольная группа | Опытная группа | |
Масса тела, г | 251,5 (248,7-255) | 363 (360,5-370,7)** | |
Масса печени, г | 5,9 (5,84-5,95) | 10,9 (10,00-12,53)** | |
Массовый коэффициент печени, % | 2,38 (2,29-2,42) | 3,07 (2,66-3,46)* | |
Глюкоза натощак, ммоль/л | 4,95 (4,83-5,15) | 7,55 (7,43-7,68)** | |
ПГТТ | 30 мин. | 7,17 (7,1-7,35) | 9,15 (8,95-9,28)** |
60 мин. | 6,45 (6,3-6,75) | 9,4 (9,23-9,5)** | |
90 мин. | 5,65 (5,6-5,7) | 8,45 (8,33-8,73)** | |
120 мин. | 5,16 (5,12-5,22) | 7,95 (7,75-8,08)** | |
Холестерин, ммоль/л | 1,6 (1,56-1,64) | 2,25 (2,13-2,45)** | |
ЛПВП, ммоль/л | 0,98 (0,97-0,99) | 0,72 (0,69-0,74)** | |
Триглицериды, ммоль/л | 0,59 (0,48-0,69) | 1,34 (1,28-1,4)** | |
КА, % | 0,64 (0,61-0,71) | 2,17 (1,97-2,35)** | |
Примечание: Me (Q25-Q75); *, ** – достоверная разница между опытной группой и контролем при p ≤ 0,05 и p ≤ 0,01; ПГТТ – пероральный глюкозотолерантный тест; КА – коэффициент атерогенности
В опытной группе наряду с избыточной массой тела отмечалось увеличение массы печени на 84,7% и её массового коэффициента на 29%. По результатам биохимического анализа крови к концу исследования было установлено статистически значимое увеличение уровня глюкозы на 52,5%, общего холестерина на 40,6%, триглицеридов на 127%, коэффициент атерогенности на 239% и снижение уровня ЛПВП на 26,5%. Наблюдаемые атерогенные сдвиги в липидном профиле происходили на фоне снижения ЛПВП и повышения уровня холестерина и триглицеридов, что привело к увеличению коэффициент атерогенности, отражающего риск развития поражения сосудов. Результаты перорального глюкозотолерантного теста к 12 недели эксперимента показали существенные различия между опытной и контрольной группами. Уровень глюкозы после нагрузки в контрольной группе стал снижаться после 30 минуты и к 120 минуте возвращался к практически исходным значениям; в то время как в опытной группе снижение начиналось только после 60 минуты, что может свидетельствовать о нарушениях углеводного обмена. Нарушение толерантности к глюкозе является предиктором сахарного диабета 2 типа и служит фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний . Полученные данные могут свидетельствовать о развивающейся на фоне избыточного веса инсулинорезистентности, которая, в свою очередь, будет усугублять накопление и задержку жира в организме.
Рисунок 1 - Фрагмент ткани печени крысы контрольной группы:
а – Ув. об. 20; ок. 10; б – Ув. об. 40; ок 10
Примечание: фиксация – 10% раствор нейтрального формалина, окраска – гематоксилин Майера и эозин
Рисунок 2 - Фрагмент ткани печени крысы опытной группы:
а – Ув. об. 20; ок. 10; б – Ув. об. 40; ок. 10
Примечание: фиксация – 10% раствор нейтрального формалина, окраска – гематоксилин Майера и эозин
Рисунок 3 - Влияние высококалорийной диеты на концентрацию SCD-1 в сыворотке крови (а) и печени (б) лабораторных животных
Примечание: ** – достоверная разница между опытной группой и контролем при p ≤ 0,01
Известно, что при жировой дистрофии печени жирные кислоты накапливаются в гепатоцитах, что по мнению многих исследователей, обусловлено нарушением окислительных процессов . Ряд экспериментальных исследований показывают, что изменение внутриклеточного метаболизма липидов в печени при жировой дистрофии сопровождается нарушением функционально-структурной целостности клеточных мембран из-за нарушения текучести мембран и изменения их проницаемости . Наблюдаемые в нашем исследовании изменения в виде развития мелкокапельной жировой дистрофии у животных опытной группы закономерны на фоне увеличения массового коэффициента печени и увеличения уровня SCD.
В настоящее время у приматов и человека выделено две изоформы фермента (SCD-1 и SCD-5), а у грызунов – четыре (SCD-1-4). Изоформа SCD-1 грызунов является ортологом SCD-1 человека, которые на 85% гомологичны , . SCD представляет собой микросомальный фермент, локализованный в эндоплазматическом ретикулуме. Реакции, контролируемые данными ферментами, называются реакциями десатурации, они катализируют стадию ограничения скорости биосинтеза ненасыщенных жирных кислот в клетках человека и животных путем введения цис-двойной связи в Δ9-положении. В результате реакции десатурации стеариновой (C18:0) и пальмитиновой (С16:0) насыщенных жирных кислот образуются олеиновая (C18:1n-9) и пальмитолеиновая (C16:1n-7) кислоты, которые являются основными мононенасыщенными жирными кислотами в жировых депо и мембранных фосфолипидах. Работа SCD важна для поддержания нормальных физиологических процессов . Полученные нами данные демонстрируют, что уровень SCD чувствителен к изменениям в питании. Большинство метаболических изменений, связанных с нарушениями углеводного и липидного обменов ассоциируют с соотношением мононенасыщенных жирных кислот к насыщенным жирным кислотам . Данное соотношение контролирует структурную целостность и текучесть мембран клеток, тем самым влияя на широкий спектр физиологических функций. Достоверное увеличение уровня печеночной SCD в опытной группе может быть косвенным свидетельством нарушения соотношения мононенасыщенных жирных кислот к насыщенным жирным кислотам в печени, а также нарушения проницаемости мембран клеток. Согласно результатам исследований ряда авторов, доказана роль SCD при патогенезе многочисленных патологических состояний, включая ожирение, сахарный диабет 2 типа и сердечно-сосудистые заболевания , .
Таким образом, поддержание адекватного уровня мононенасышенных жирных кислот, посредством регуляции уровня SCD является основополагающим фактором для сохранения состояния здоровья организма.
4. Заключение
1. Представленный рацион позволяет моделировать нарушения метаболизма и доказывают эффективность его дальнейшего использования в исследованиях по изучению нарушений углеводного и липидного обменов на лабораторных животных.
2. Полученные данные демонстрируют, что концентрация SCD чувствительна к изменениям в питании. Длительная высококалорийная диета приводит к достоверному увеличению уровня SCD-1 в печени на 19,3%.