CLONING AND SEQUENTIAL METHODS USING IN THE ANALYSIS OF A MICROBIAL COMMUNITY ALLOCATED FROM ORE OF SHANUCH DEPOSIT

Рогатых С.В.

¹ORCID: 0000-0002-7651-7474, кандидат биологических наук,

Научно-исследовательский геотехнологический центр Дальневосточного отделения Российской академии наук в г. Петропавловске-Камчатском

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ КЛОНИРОВАНИЯ И СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПРИ АНАЛИЗЕ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ РУДЫ МЕСТОРОЖДЕНИЯ ШАНУЧ

Аннотация

Приведен анализ состава сообществ хемолитотрофных ацидофильных микроорганизмов сульфидных руд месторождения Шануч (полуостров Камчатка) с применением молекулярно-биологических подходов. С использованием методов клонирования и секвенирования показана модель исследования состава ассоциаций хемолитотрофных микроорганизмов в процессах биовыщелачивания. Результаты исследований показали, что подавляющее большинство нуклеотидных последовательностей принадлежит представителям рода Acidithiobacillus. Также было обнаружено наличие последовательностей других альфапротеобактерий и архей.

Ключевые слова: выщелачивание, клонирование, хемолитотрофные микроорганизмы, полимеразная цепная реакция, биотехнология.

Rogatykh S.V.

¹ORCID: 0000-0002-7651-7474, PhD in Biology,

Geotechnological Scientific Research Center of Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences in Petropavlovsk-Kamchatsky

CLONING AND SEQUENTIAL METHODS USING IN THE ANALYSIS OF A MICROBIAL COMMUNITY ALLOCATED FROM ORE OF SHANUCH DEPOSIT

Abstract

The analysis of chemolithotrophic acidophilic microorganisms communities composition of sulphide ores of the Shanuch deposit (Kamchatka peninsula) using molecular biological approaches is given. Using the methods of cloning and sequencing, a model for studying the composition of associations of chemolithotrophic microorganisms in bioleaching processes is shown. The results of the studies showed that the overwhelming majority of nucleotide sequences belong to representatives of the genus Acidithiobacillus. Also, the presence of sequences of other alpha-proteinobacteria and archaea has been found.

Keywords: leaching, cloning, chemolithotrophic microorganisms, polymerase chain reaction, biotechnology.

Создание новых и развитие существующих методов получения цветных металлов из сульфидных руд, характеризующихся сложным вещественным составом, является актуальной научной задачей, ее решение будет способствовать получению новых научных знаний о сообществах хемолитотрофных микроорганизмов и развитию перспективных промышленных биотехнологий. Сейчас для извлечения металлов из сложных сульфидных концентратов широко предлагаются и используются энергозатратные методы – автоклавное и высокотемпературное выщелачивание, высокоэнергетические воздействия, пирометаллургические методы и пр. [3], [5]. Изучение механизмов вскрытия сульфидных минералов в ходе выщелачивания с применением культур микроорганизмов будет способствовать совершенствованию методов биогеотехнологии и их более широкому внедрению в горно-перерабатывающих отраслях [8].

Целью нашего исследования стал анализ автохтонного сообщества, выделенного из медно-никелевых руд Камчатской никеленосной провинции, а конкретно – месторождения Шануч с применением методов клонирования и секвенирования.

Метод клонирования основан на применении бактериальных клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК. Фрагмент ДНК встраивается в плазмиду-переносчик, при этом образуется новая плазмида. При обработке большого количества клеток некоторые из них поглощают рекомбинантную плазмиду и реплицируют плазмиду вместе с собственным геномом. Из полученного клона выделяют плазмиду, содержащую множество копий клонированного фрагмента ДНК [1].

Метод ферментативного секвенирования в настоящее время остается самым распространенным методом определения нуклеотидной последовательности ДНК [9]. В основе метода лежит использование видоизмененных аналогов трифосфатов – дидезоксинуклеотидов. В них отсутствует 3’-гидроксильная группа, которая не дает образовываться фосфодиэфирной связи со свободным нуклеотидом. Общий механизм реакции не отличается от такового при обычной полимеразной ценой реакции. ДНК-полимераза достраивает комплементарную цепь, но как только к этой цепи присоединяется дидезоксинуклеотид, ее синтез прекращается. Присоединение дидезоксинуклеотида происходит случайно и в пробирке образуется набор ампликонов разной длины, начиная от праймер+1 нуклеотид, заканчивая общей длиной амплифицируемого фрагмента. Современные секвенаторы разделяют эти фрагменты, пропуская всю смесь через наполненные гелем капилляры. Сам процесс капиллярного электрофореза так эффективен, что фрагмент, только что вышедший из капилляра, оказывается ровно на один нуклеотид длиннее, чем предшествующий ему. По мере того как фрагмент появляется, он детектируется лазерной системой, сигналы из которой поступают в компьютер, где и интерпретируются.

Для анализа мы использовали микробные культуры ацидофильных хемолитотрофов видов Acidithiobacillus thiooxidans, A. ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans и Ferroplasma acidiphilum из коллекции ФИЦ «Биотехнология» РАН и смешанные культуры аборигенных сообществ, отобранных с руды Шанучского месторождения.

Очистку ДНК осуществляли с помощью стандартной методики фенол-хлороформной экстракции [2]. ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе ДТ-96 (ЗАО «ДНК-Технология») по программе: 95^оС – 30 с, T_M – 30 с, 72^оС – 20 с (35 циклов) [3], с использованием праймеров upr2-d (5’TGCATGGCYGTCGTCAGCTCGT-3’) и upr3-r (5’ TGACGGGCGGTGTGTRCAAGG-3’). Клонирование вектором «pGemTeasy» на культуре E. coli проводилось на базе ЗАО «Евроген». Для интерпретации результатов сиквенсной реакции использовали программу ChromasPro 1.33 и ресурс сервера NCBI.

Сохранение исходного соотношения копий геномов микроорганизмов разных видов, представляет собой сложную задачу. Нарушение этого соотношения может повлиять на результат дальнейших исследований. Если используемые в реакции праймеры амплифицируют фрагменты ДНК различных видов с равной эффективностью, можно говорить о том, что смесь НК будет содержать фрагменты специфичные для основных видов анализируемого сообщества, и, при этом, исходное соотношение НК каждого микроорганизма будет сохраняться. Из-за дороговизны определения полногеномной последовательности, а также из-за универсальности (этот ген встречается у всех эубактерий и архей) ген 16S рРНК стал распространенным инструментом молекулярной систематики и повсеместно используется при проведении филогенетических исследований [10]. Ген сдержит несколько вариабельных областей позволяющих проводить сравнительный анализ последовательностей на различных таксономических уровнях. В то же время последовательность гена в целом достаточно консервативна, что значительно усложняет анализ ДНК, принадлежащих близкородственным микроорганизмам [4].

Таким образом, при выяснении видового состава комплексных сообществ микроорганизмов методом анализа библиотек клонов, мы оказываемся ограничены двумя обстоятельствами: с одной стороны необходимо выбрать консервативный фрагмент, встречающийся у подавляющего большинства известных эубактерий и архей, а с другой стороны, этот фрагмент должен содержать вариабельный участок, который в последствии позволил бы нам определить микроорганизмы, входящие в состав пробы, до вида. Если учесть еще и ограничения, налагаемые на последовательность самого праймера (его длина и нуклеотидный состав), приходится признать такую задачу трудно невыполнимой.

Поэтому одной из наших основных задач стала проверка универсальной пары праймеров, обеспечивающей одинаковую эффективность ПЦР при амплификации гена 16S рРНК всех эубактерий и архей, присутствующих в анализируемом образце. Для этого с ДНК чистых линий культур с использованием вышеупомянутых праймеров была проведена ПЦР в реальном времени [7], которая показала приблизительно одинаковое значение DСt (15-17). Это свидетельствовало о том, что выбранные праймеры обеспечивают равную эффективность амплификации фрагмента гена 16S рРНК основных представителей микроорганизмов руды месторождения Шануч.

При создании библиотеки клонированных фрагментов гена 16S рРНК были получены четыре чашки Петри с рассеянными колониями E. coli. Из них отобраны 80 колоний, которые содержали вставку ПЦР-продукта. С учетом данных литературы, библиотека в 80-100 клонов является достаточной при проведении подобного рода исследований [1]. Последовательности, полученные при секвенировании 80 отобранных клонов, были проанализированы с использованием алгоритма BLAST сервера NCBI. Из 80 последовательностей гена 16S рРНК 77 принадлежали представителям рода Acidithiobacillus sp., две – представителям рода Tiobacillus sp., одна – архее F. acidifillum.

Проведенное нами сравнение последовательностей генов 16S рРНК позволило определить участки, нужные для идентификации различных родов, которые, как предполагалось по данным микроскопического анализа, входили в состав исследуемых образцов. Недостатком выбранного фрагмента ДНК стала его идентичность у представителей рода Acidithiobacillus и, как следствие, невозможность отличить A. ferrooxidans от A. thiooxidans. Однако в природе эти два вида, во-первых, являются доминирующими, а, во-вторых, практически всегда встречаются вместе [6]. Как уже отмечалось выше, на долю A. ferrooxidans приходится основная окислительная активность, а A. thiooxidans обеспечивает оптимальные условия для протекания окислительных процессов. Результаты данного исследования позволит восполнить пробел, сформировавшийся в биогеотехнологии с начала 90-х гг. 20 в., но получивших бурное развитие за рубежом, в том числе, благодаря разработкам советских и российских ученых.

Особую благодарность при проведении настоящего исследования хочется выразить д.б.н., профессору И.А. Кофиади, А.А. Докшукиной, к.б.н., доценту Мурадову, к.т.н. Левенец, к.б.н. Хайнасовой.

Список литературы / References

1. Bowei C. Application of clone library analysis and real-time PCR for comparison of microbial communities in a low-grade copper sulfide ore bioheap leachate / C. Bowei, L. Xingyu, L. Wenyan, W. Jiankang // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2009. – Vol. 36. – P. 1409–1416.
2. Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. – 1987. – Vol. 162. – No. 1. – P. 156–159
3. Ehrlich H. L. Past, present and future of biohydrometallurgy / H. L. Ehrlich // Hydrometallurgy. – 2001. – № 59. – Р. 127–134.
4. Lee Z. M. rrnDB: documenting the number of rRNA and tRNA genes in bacteria and archaea / Z. M. Lee, C. Bussema, T. M. Schmidt // Nucl. Acids Res. – 2009. – Database issue. – P. 1–5.
5. Norris P. R. Acidophiles in bioreactor mineral processing / P. R. Norris, N. P. Burton, N. A. Foulis // Extremophiles. – 2000. – Vol. 4. – P. 71–76.
6. Rawlings D. E. Characteristics and adaptability of iron- and sulfuroxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates / D. E. Rawlings // Microbial cell factories. – 2005. – Vol. 4. – No. 13. – P. 1–15.
7. Rogatykh S. V. Evaluation of quantitative and qualitative composition of cultivated acidophilic microorganisms by real-time PCR and clone library analysis / S. V. Rogatykh, A. A. Dokshukina, O. O. Levenets and others // Microbiology. – 2013. – Vol. 82. – No. 2. – P. 210–214.
8. Sand W. (Bio) chemistry of bacterial leaching – direct vs. indirect bioleaching / W. Sand, T. Gehrke, P.-G. Jozsa, A. Schippers // Hydrometallurgy. – 2001. – Vol. 59. – P. 159–175.
9. Sanger F. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase / F. Sanger, A. R. Coulson // J. Mol. Biol. – 1975. – Vol. 94. – No. 3. – P. 441–448.
10. Tributsch H. Direct vs indirect bioleaching / H. Tributsch // Hydrometallurgy. – 2001. – Vol. 59. – P. 177–185.