A CLUSTER ANALYSIS OF ARTICULAR CARTILAGE TISSUE STRUCTURES IN EXPERIMENTAL OSTEOARTHRITIS IN RATS

Остеоартроз (ОА) является одним из самых распространённых заболеваний, им страдает свыше 200 миллионов человек в мире и наблюдается неуклонная тенденция к возрастанию частоты ОА

В настоящее время актуальной является разработка алгоритмов применяемых к изображениям гистологических препаратов с целью повышения эффективности их анализа

Целью данной работы стало проведение пилотного исследования по использованию кластерного анализа для выявления тканевых структур суставного хряща в норме и при экспериментальном ОА у крыс.

Образцы суставного хряща были взяты у 12 белых крыс самцов линии Wistar, массой 250–300 г. Все манипуляции проводили в соответствии с этическими нормами, изложенных в «Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных» и директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях. Выведение животных осуществляли с помощью внутрибрюшинного введения десятикратной дозы препарата «Рометар», Россия (200 мг/кг массы). В работе было сформировано 2 группы по 6 животных: интактная (интакт) и с экспериментальным ОА (ОА3), моделирование которого осуществлялось путем внутрисуставного введения суспензии стерильного медицинского талька («АГАТ-МЕД», Россия)

Для выявления зональной структуры и группировки хондроцитов на кластеры учитывали их площадь, периметр, длину, ширину и положение центра по X и Y осям, с целью определения локализации этих клеток относительно глубины суставного хряща. При подсчете этих параметров суставной хрящ располагался так, чтобы поверхностная зона находилась снизу, а его глубокая зона – сверху. Так, наименьшие значения по оси Y принимали центры тех клеток, которые располагались ближе к поверхности хряща. Для кластеризации был использован метод к-средних. Все клетки, в пределах участка шириной 100 мкм, разделялись на 4 кластера, которые представляли собой 4 зоны суставного хряща: 1 — поверхностная; 2 — промежуточная; 3 — глубокая; 4 — кальцинированная. Кластеризацию проводили по всем измеряемым параметрам. Для начального положения центров кластеров задавали значение k-means++ и проводили 12 итераций. Полученные кластеры каждого участка визуализировали по трем параметрам с помощью библиотеки matplotlib.

Количественные данные обрабатывали с помощью программы Statistica 12.0 (StatSoftInc., США) с расчетом медианы, 1-ого квартиля и 3-ого квартиля. Для оценки достоверности различий был применен критерий Манна-Уитни (p <0,05).

У интактных крыс отсутствовали какие-либо повреждения суставного хряща, а именно суставные поверхности имели гладкий рельеф и четкие границы всех исследуемых зон (оценка по шкале OARSI — 0 баллов). Через три недели после введения медицинского талька выявлялись значительные повреждения суставного хряща коленного сустава. Было зафиксировано частичное или полное разрушение хрящевой ткани, множество гипертрофированных хондроцитов, а также сильное изменение рельефа суставной поверхности, а также образование новых Гаверсовых каналов (оценка по шкале OARSI — 2–3 балла).

В результате анализа изображения суставного хряща в норме и при экспериментальном ОА были получены значения каждого из исследуемых параметров для каждого кластера. Статистический анализ показал достоверные различия у ряда параметров 4 кластера между суставным хрящом интактной группы и экспериментального ОА (рис. 1). В других кластерах статически значимых различий параметров клеточных элементов обнаружено не было (p >0,05).

Рисунок 1 - Исследуемые параметры 4 кластера (кальцинированной зоны) суставного хряща в норме и при экспериментальном ОА через 3 недели

DOI:10.23670/IRJ.2023.137.157.1

У интактных животных и в группе с экспериментальным ОА в четвертом кластере параметры Х и Y не имели статистически значимых различий (p >0,05). У интакных крыс, с учетом неповрежденного хряща с нормальной кальцинированной зоной (кластер 4) и отсутствием повреждений поверхностной зоны (кластер 1), значения площади и периметра хондроцитов, а также их высоты были выше по сравнению с экспериментальным ОА в 1,3 раза соответственно (p <0,05). Это может свидетельствовать о том, что при экспериментальном ОА происходит деградация хрящевой ткани и ее дифференцировка в кальцинированную костную ткань, а также разрушение поверхностной зоны, что приводит к гибели хондроцитов, а клетки, находящиеся на условной границе глубокой зоны промежуточной зоны, имеют меньшие размеры и большое число, что в дальнейшем может привести к патологической кластеризации и потере биомеханических свойств суставного хряща

[11]

.

После проведения кластеризации, выявленные кластеры и клеточные элементы, включенные в них, сравнивали по качеству распределения и соответствия структурным зонам суставного хряща (рис. 2).

У большинства интактных животных распределение на кластеры соответствовало нормальной пространственной организации клеток в зонах суставного хряща. При экспериментальном ОА нарушалась слоистая структура хряща и кластеры распределялись неравномерно, а также наблюдалось их перемешивание. Этому могло способствовать разрушение суставного хряща, его кальцификация и гибель хондроцитов с характерным фенотипом. В результате алгоритм кластеризации распределял оставшиеся клеточные элементы на четыре кластера, в то время как четвертый кластер, соответствующий кальцинированной зоне, имел значительные изменения.

Рисунок 2 - Кластеризация хондроцитов суставного хряща тибиального плато крыс интактной группы (А-Д) и группы с ОА (Е-К) на 4 структурные зоны по параметрам X и Y положения центра клеток, площади, периметра, высоты и ширины клеток с визуализацией в трех плоскостях

Примечание: А и Е - ось X – это площадь клеток, ось Y – положение клеток по оси Y в суставном хряще, а ось Z – положение клеток по оси X в суставном хряще; Б и Ж - ось X – это периметр клеток, ось Y – положение клеток по оси Y в суставном хряще, а ось Z – положение клеток по оси X в суставном хряще; В и З - ось X – это высота клеток, ось Y – положение клеток по оси Y в суставном хряще, а ось Z – положение клеток по оси X в суставном хряще; Г и И - ось X – это ширина клеток, ось Y – положение клеток по оси Y в суставном хряще, а ось Z – положение клеток по оси X в суставном хряще; Д – участок суставного хряща тибиального плато интактной группы в увеличении 20х, с которого были получены и представлены данные по указанным параметрам (А-Г); К – участок суставного хряща тибиального плато при ОА в увеличении 20х, с которого были получены и представлены данные по указанным параметрам (Е-И). Голубым цветом обозначены кластеры кальцинированной зоны; красным – глубокой; синим – промежуточной; желтым – поверхностной

DOI:10.23670/IRJ.2023.137.157.2

На качество распределения кластеров оказывал сильное влияние правильный подбор параметров, от комбинации которых зависело в какую группу будет определена каждая клетка. Сложность выполнения качественного распределения на зоны суставного хряща заключалась в том, что некоторые хондроциты имели схожие значения параметров, при этом обладая различным фенотипом. 

Принципиальный вклад в распределение на кластеры вносили те параметры, значения которых значительно отличались друг от друга среди объектов. Так, если из большого количества объектов только несколько имели высокое значение площади, они выносились в отдельный кластер, поэтому включение такого параметра могло привести к отрицательным результатам.

Таким образом, в ходе исследования проведены пилотные опыты по использованию кластерного анализа для выявления структурных изменений суставного хряща тибиального плато в норме и при экспериментальном остеоартрозе. В результате были выявлены изменения параметров хондроцитов четвертого кластера, соответствующего кальцинированной зоне суставного хряща. Визуализация результатов кластерного анализа показала, что при экспериментальном остеоартрозе через 3 недели происходит изменение кластеров и их пространственного распределения по сравнению с интактным состоянием. 

Результаты пилотного исследования применения кластерного анализа могут быть использованы для дальнейшего изучения суставного хряща и других тканей, с учетом применения или оптимизации уже существующих алгоритмов в зависимости от целей и задач исследования.