INFLUENCE OF INTRAUTERINE CHRONIC ETHANOL INTOXICATION ON THE GABA METABOLISM IN THE TISSUE OF DIFFERENT CENTRAL NERVOUS SYSTEM STRUCTURES OF THE THREE MONTH OLD RABBITS

Мамедова И.А.

Аспирант, Азербайджанский Государственный Педагогический Университет в г. Баку

ВЛИЯНИЕ ВНУТРИУТРОБНОЙ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ЭТАНОЛОМ НА МЕТАБОЛИЗМ ГАМК В ТКАНЯХ РАЗЛИЧНЫХ СТРУКТУР ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ТРЕХ МЕСЯЧНЫХ КРОЛИКОВ

Аннотация

В работе представлены экспериментальные данные о влиянии внутриутробной хронической интоксикации этанолом на обмен гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в тканях различных структур центральной нервной системы (ЦНС) трех месячных кроликов. Результаты наших исследований показали, что при пренатальном хроническом воздействии этанола происходит увеличение содержания ГАМК, уменьшение содержания свободных глутаминовой и аспарагиновой кислот (Глу и Асп), повышение активности фермента глутаматдекарбоксилазы (ГДК) и понижение активности фермента ГАМК-Т в тканях структур головного мозга трех месячных кроликов. Вероятно, что ГАМК как медиатор торможения активно принимает участие в патогенезе внутриутробной интоксикации этанолом ЦНС и всего организма, защищая нервные клетки и организм от вредного воздействия и участвует в механизме приспособления к указанным условиях и защитно-компенсаторных процессах в ЦНС.

Ключевые слова: гамма-аминомасляная кислота, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, глутаматдекарбоксилаза, ГАМК-аминотрансфераза, этанол.

Mammadova I.A.

Postgranduate student, Azerbaijan State Pedagogical University in Baku

INFLUENCE OF INTRAUTERINE CHRONIC ETHANOL INTOXICATION ON THE GABA METABOLISM IN THE TISSUE OF DIFFERENT CENTRAL NERVOUS SYSTEM STRUCTURES OF THE THREE MONTH OLD RABBITS

Abstract

The paper presents experimental data on the effect of intrauterine chronic ethanol intoxication on the metabolism on GABA in the tissues of the different central nervous system (CNS) structures of the three month old rabbits. Our results showed that chronic exposure to ethanol leads to upregulation of GABA, downregulation of free Glu and Asp, increase activity of GAD and decrease activity of GABA-T in the tissues of brain structures of three month old rabbits in prenatal ontogenesis.  Is possible that GABA as an inhibitory neurotransmitter can be actively involved in the pathogenesis of in utero ethanol intoxication of organism and CNS, via protecting nerve cells and the organism from its adverse effect and by involving in the mechanism of adaptation and protective-compensatory processes in the CNS in these conditions.

Keywords: GABA, Glutamic acid, Aspartic acid, glutamate acid decarboxylase, GABA-transferase, ethanol.

В комплексе медико-биологических проблем последних десятилетий особое место занимает исследование широкого диапазона вредного влияния алкоголя на состояние здоровья как самого злоупотребляющего алкогольными напитками, так и на здоровье его потомства, отрицательного воздействие на благосостояние семьи и общества.

В настоящее время установлено, что этанол, независимо от сроков беременности, быстро переходит через гемато-плацентарный барьер. Алкоголь, употребляемый беременными, оказывает как прямое, так и опосредованное тератогенное и фетотоксическое действие на плод. Тяжёлыми последствиями алкоголизма женщины являются гибель зародыша на ранних этапах эмбриогенеза, высокая перинатальная заболеваемость и смертность, рождение детей с задержкой перинатального развития, различные врождённые аномалии, метаболические и функциональные нарушения, дефекты развития ЦНС, в частности, прогрессирующая психическая неполноценность [4].

Одно из важнейших мест в формировании признаков алкогольной интоксикации занимают изменения под влиянием этанола функционирования нейромедиаторов головного мозга [12]. ГАМК-ергическая система, по мнению большинства авторов, играет значительную роль в развитии алкоголизма, так как является одной из основных точек приложения этанола при возникновения его психотропных эффектов [3].

В эмбриогенезе плацентарных млекопитающих различают два критических периода: первый – на начальный стадии развития, когда зародыш только начинает продвигаться по яйцеводу, второй период совпадает со стадиями развития, когда зародыш вступает в период основного органогенеза [6]. В эти критические периоды развития ЦНС насыщена различными клеточными, тканевыми и митохондриальными изменения, которое до сих пор остаются малоизученными. Несмотря на признание факта ранимости нейронов структур головного мозга в эмбриональном и плодном периодах, отсутствуют сведения о том, на какой стадии пренатального развития под действием экстремального фактора внешней среды, в частности при алкогольной интоксикации, возникают патологические изменения в нервной системе и как они проявляются в постнатальном онтогенезе человека и животных.

Таким образом, кроликов, получавших внутриутробно хроническую алкогольную интоксикацию изучение различных параметров ГАМК-системы в головном мозге необходимым для выяснения механизмов пренатальной действия этанола в мозге.

Материалы и методы

Исследования выполнены на кроликов, полученных от взрослых самок, в соответствии с биоэтическими принципами и нормативными документами, рекомендованными. Двух половозрелых самок подсаживали к самцу, далее фиксировали срок беременности – определяли наличие сперматозоидов в вагинальном мазке самки, при этом первым днем беременности считался день обнаружения сперматозоидов в вагинальном мазке.

Экспериментальные животные были разделены на следующие группы: 1) контрольная группа  – интактные животные; 2) опытная группа №1 - самки, подвергавшиеся хронической интоксикации 3,5 г/кг дозой этанола, и их потомство, 3) опытная группа №2 - самки, подвергавшиеся хронической интоксикации 5,6 г/кг дозой этанола, и их потомство.

Хроническую интоксикацию 3,5 г/кг и 5,6 г/кг дозой этанола проводили на 1-10-е сутки. Беременности введением этанола один раз в день (внутрибрюшинно) в течение 10 дней.

Отделы мозга (кора больших полушарий головного мозга, мозжечок, ствол мозга и гипоталамус) анализировали у интактных и опытных трех месячных крольчат. Сразу после декапитации животных извлеченный мозг помещают на лед. Ткань мозга обрабатывали согласно методу Робертса [8] в модификации [9].

Для разделения свободных аминокислот (ГАМК, Глу и Асп) методом электрофореза на бумаге [7] применяли буферную смесь: вода-ледная уксусная кислота – пиридин (44:8:1) при рН 3,5. Аминокислоты разделяли при напряжении 350 В и сила тока 12,5 мА в течение 4 ч.

Активность ГДК в нервной ткани определяли известным методом, предложенным И.А.Сытинским и Т.Н.Пряткиной [10]. Активность фермента ГАМК-Т определяли по методу Н.С.Ниловой [5] и выражали в микромолях Глу, образовавшейся на 1 г свежей ткани за 1 ч. Все эксперименты проводили согласно «Правилам работы с использованием экспериментальных животных». Полученные данные были статистически обработаны непараметрическим методом Манна-Уитни для независимых выборок [2].

Результаты и их обсуждения

Результаты проведенных исследований, показали что у 3-х месячных крольчат в контроле содержание ГАМК составляет в кора больших полушарий  мозга 2,24±0,066, в мозжечке 1,74±0,039, в стволе мозга, 2,12±0,038, в гипоталамуса 2,62±0,039 мкмоль/г (табл. 1). У кроликов, перенесших пренатальную хроническую интоксикации 3,5 г/кг дозы этанола наблюдается выраженные нарушения обмена ГАМК. При этом содержания ГАМК возрастает:  в кора больших полушарий  мозга – 20%, в мозжечке – 22%, в стволе мозга 31%, в гипоталамуса – 26%.

Содержание свободной Глу у 3-х месячных крольчат в тканях избранных структур ЦНС после внутриутробного воздействия хронической интоксикации 3,5 г/кг дозы этанола снижается. Таким образом, в контроле содержание свободной Глу в ткани коры больших полушарий головного мозга составляет - 4,87±0,082, мозжечке – 4,17±0,064, стволе мозга - 4,65±0,066, в гипоталамуса - 4,94±0,03 мкмоль/г. У 3-х месячных кроликов, перенесших пренатальную хроническую алкогольную интоксикацию (3,5 г/кг) содержания Глу в кора больших полушарий  мозга - 12%, в мозжечке – 7%, в стволе мозга 10%, в гипоталамуса – 7% уменьшается. При этом содержание свободной Асп в тканях исследованных структур ЦНС также уменьшается: в кора больших полушарий  мозга – 21%, в мозжечке – 14%, в стволе мозга 14%, в гипоталамуса – 15%.

У 3-х месячных кроликов, получавших внутриутробно хроническую алкогольную интоксикацию высокой дозой алкоголя (5,6 г/кг), содержание ГАМК увеличивается в ткани больших полушарий головного мозга - 28%, в мозжечке - 34%, в стволе мозга - 42%, гипоталамуса - 38% по сравнение контрольными показателями. Содержание свободной Глу в тканях изучаемых структур головного мозга после внутриутробного воздействия хронической интоксикации этанола (5,6 г/кг), в отличие от уровня ГАМК адекватно снижается (в кора больших полушарий  мозга – 18%, в мозжечке – 11%, в стволе мозга 15%, в гипоталамуса – 12%). При этом содержание свободной Асп в тканях избранных структур ЦНС также уменьшается (в кора больших полушарий  мозга – 15%, в мозжечке – 18%, в стволе мозга 19%, в гипоталамуса – 20%).

 

Таблица 1 - Влияние внутриутробной хронической интоксикации этанолом (3,5 г/кг и 5,6 г/кг в течение 10 дней) на содержание ГАМК, Глу и Асп (мкмоль/г) в тканях структур ЦНС 3-х месячных кроликов (M±m, n=5)

Структуры мозга	Опыты	Показатели	ГАМК	Глу	Асп
Кора больших полушарий	Контроль	M±m	2,24±0,066	4,87±0,082	2,78±0,041
	3,5 г/кг	M±m	2,69 ±0,058***	4,29 ±0,086**	2,20 ±0,05***
		%	120	88	79
	5,6 г/кг	M±m	2,87 ±0,062***	3,99 ±0,078***	2,36 ±0,065***
		%	128	82	85
Мозжечок	Контроль	M±m	1,74±0,039	4,17±0,064	2,64±0,03
	3,5 г/кг	M±m	2,12 ±0,041***	3,88 ±0,07*	2,27 ±0,059***
		%	122	93	86
	5,6 г/кг	M±m	2,33 ±0,054***	3,71 ±0,047***	2,16 ±0,031***
		%	134	89	82
Ствол мозга	Контроль	M±m	2,12±0,038	4,65±0,066	2,52±0,028
	3,5 г/кг	M±m	2,78 ±0,066***	4,19 ±0,058***	2,17 ±0,052***
		%	131	90	86
	5,6 г/кг	M±m	3,01 ±0,058***	3,95 ±0,067***	2,04 ±0,04***
		%	142	85	81
Гипоталамус	Контроль	M±m	2,62±0,039	4,94±0,03	3,14±0,06
	3,5 г/кг	M±m	3,3 ±0,064***	4,59 ±0,077**	2,67 ±0,037***
		%	126	93	85
	5,6 г/кг	M±m	3,62 ±0,062***	4,35 ±0,075***	2,51 ±0,03***
		%	138	88	80

* - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001.  

Результаты следующих серий опытов показали, что внутриутробного хронического воздействия 3,5 г/кг дозы этанола активность ГДК в изучаемых структур головного мозга повышается (табл. 2). Это повышение в ткани коры больших полушарий составляет 17 %, в мозжечке - 20%, в стволе мозга - 22%, в ткани гипоталамуса 15%. Активность фермента ГАМК-Т в указанных условиях в тканях коры больших полушарий головного мозга, мозжечка, ствола мозга и гипоталамуса по сравнение с контролем понижается на 8, 12, 12 и 10%, соответственно.

Выявлено, что у трех месячных кроликов, получавших внутриутробно хроническую интоксикацию высокой дозой этанола (5,6 г/кг) активность фермента ГДК в изучаемых структур головного мозга по сравнение с контролем повышается (в ткани больших полушарий головного мозга - 26%, в мозжечке - 29%, в стволе мозга - 33%, гипоталамуса - 24%). Активность фермента ГАМК-Т в указанных условиях в тканях коры больших полушарий головного мозга, мозжечка, ствола мозга и гипоталамуса по сравнение с контролем наоборот понижается на 13, 20, 18 и 15%, соответственно.

 

Таблица 2 - Влияние внутриутробной хронической интоксикации этанолом (3,5 г/кг и 5,6 г/кг в течение 10 дней) на активность ферментов ГДК (мкмоль ГАМК/г·ч) и ГАМК-Т (мкмоль Глу/г·ч) в тканях структур ЦНС 3-х месячных кроликов (M±m, n=5)

Структуры мозга	Опыты	Показатели	ГДК	ГАМК-Т
Кора больших полушарий	Контроль	M±m	59,4±1,96	91,4±1,69
	3,5 г/кг	M±m	69,5±1,51**	84,1±1,39**
		%	117	92
	5,6 г/кг	M±m	74,8±1,4***	79,5±1,29***
		%	126	87
Мозжечок	Контроль	M±m	85,6±1,8	95,8±1,72
	3,5 г/кг	M±m	102,7±0,93***	84,3±1,53**
		%	120	88
	5,6 г/кг	M±m	110,4±1,88***	76,6±1,63***
		%	129	80
Ствол мозга	Контроль	M±m	36,8±1,69	84,3±1,01
	3,5 г/кг	M±m	44,9±1,12**	74,2±1,54***
		%	122	88
	5,6 г/кг	M±m	48,9±1,96**	69,1±1,55***
		%	133	82
Гипоталамус	Контроль	M±m	42,2±1,67	101,6±2,13
	3,5 г/кг	M±m	48,5±1,06*	91,4±1,74**
		%	115	90
	5,6 г/кг	M±m	52,3±1,67**	86,4±1,51***
		%	124	85

* - p<0,05; ** - p<0,01; *** - <0,001.  

Проведенные исследования выявили тот факт, что после внутриутробного хронического воздействия этанола компоненты системы ГАМК больше всего претерпевают изменения в ткани мозжечка и ствола мозга. Вероятно, что эти изменения связаны с выполняемыми сложными физиологическими и биохимическими функциями и численностью ергических нейронов в этих структурах ЦНС.

Особенно, интересен факт, указывающий на разнонаправленную изменчивость общей активности ГДК и ГАМК-Т. Как видно из полученных данных при внутриутробном хроническом воздействии различных дозы этанола увеличение содержание ГАМК происходит с одной стороны за счет усиление синтез ГАМК, с другой стороны за счет уменьшение ее поглощение тканями исследованных структур головного мозга 3-х месячных кроликов.

При внутриутробном введении относительно малый дозы (3,5 г/кг) наблюдается слабовыраженные изменения в содержании и активности компонентов обмена ГАМК у 3-х месячных кроликов во всех исследованных структур головного мозга по сравнение большой дозы (5,6 г/кг). Особую роль в формировании неврологической картины внутриутробном отравления этанолом играют разнонаправленные нарушения в глутамат- и ГАМК-ергических системах головного мозга. По современным представлениям, именно эти аминокислоты являются основными нейротрансмиттерами мозга в обеспечении баланса практически всех возбуждающих и тормозных  процессов в организме [1]. На основе выше сказанному можно говорит, что при внутриутробном интоксикации этанола в головном мозге возникает дисбаланс между стимулирующими и тормозными медиаторными системами, в первую очередь ГАМК, глутаматергической.

Считается экспериментально обоснованным, что ряд поведенческих эффектов этанола обусловлен активацией ГАМКергической системы, в основе которой, как известно, лежит индукция поступления в нейроны ионов Cl^-, опосредуемого стимуляцией комплекса ГАМК-рецептор/ионный канал [11].

Во внутриутробном периоде этанол влияет на экспрессию широкого спектра белков и на процесс миграции нейронов, в результате чего нарушается количественный и качественный нейронный состав в различных областей головного мозга плода. Вероятно, что этанол оказывает воздействие на белковые структуры ферментов обмена ГАМК или же взаимодействует с их коферментом – пиридоксаль-5-фосфатом.

Многочисленные механизмы вносят свой вклад в разрушительные эффекты воздействия алкоголя на плод, особенно на развивающийся мозг. Плацента – сложный полифункциональный орган, полноценность деятельности которого зависит от многих факторов. Развивающийся плод и плацента как единое целое бурно реагируют на любые отрицательные воздействия, не свойственные нормальному, заложенному природой механизму развития.

Под влиянием алкоголя происходят активация функции плаценты, повышение в ней уровня компенсаторно-приспособительных и метаболических процессов. ГАМК при внутриутробной действия этанола очень активно выполняет свои компенсаторно-адаптивные функции, оказывая на многие системы мозга сильное тормозящее влияние, что особенно проявляется при систематических пренатальной воздействиях этанола.

На основании полученных результатов и данных литературы можно сделать заключение, что фетальный алкогольный синдром как внешние нарушения глутамат- и ГАМК-эргической влияние передачи сигналов на развитие головного мозга.

Литература

1. Курбат М.Н., Лелевич В.В. Обмен аминокислот в головном мозге //Нейрохимия. – 2009. №1(26). С.29-34.
2. Лакин Г.Ф. Биометрия // М., изд-во «Высшая школа», 1990, 325 с.
3. Лелевич С.В. Молекулярные механизмы формирование алкогольной и морфиной интоксикации: Автореф. диссертация на соискание ученой степени д.м.н: - Минск, 2015. – 47 с.
4. Малахова Ж.Л., Шилко В.И., Бубнов А.А. Фетальный алкогольный синдром у детей раннего возраста, М.: LAP Lambert Academic Publishing, 2012. - 164 с.
5. Нилова Н.С. Аммиак и ГАМК-трансаминазная активность ткани головного мозга // Докл. АН СССР, 1966, (2). С.483-486.
6. Пучков В.Ф. Учение П.Г.Светлова о критических периодах развития и его значение для современной эмбриологии // Морфология, 1993, №11(105), С.147-158.
7. Dose K. Die anwendung der hochspannungspherographic dei der guantitativen totalanigse von protein hydrolysaten // Mitteiling Biochem. – 1957.- Bd. №2(329). P.416-419.
8. Robert E., Frankel S. Gamma-aminobutyric acid in brain: its formation from glutamic acid // J.Biol., Chem., 1950, №1(187). P.55-63.
9. Shatunova N.F., Sytinsky I.A. On the intracellular localization of glutamate decarboxylase and gamma-amonibutyric acid in mammalian brain // J.Neurochem. – 1964. (11). P.701-708.
10. Sytinsky I.A., Priyatkina T.N. Effect of certain drugs on gamma-aminobutyric acid system on central nervous system // Biochem. Pharmacol., 1966, №1(115). P.49-57.
11. Toso L., Johnson A., Bissell S. et al. Understanding the mechanism of learning enhancement: NMDA and GABA receptor expression // American Journal of Obstetrics & Gynecology, 2007, № 3(197). P.267–277.
12. Ward R.J., Lallemand F., De Witte P. Biochemical and neurotransmitter changes implicated in alcohol-induced brain damage in chronic or 'binge drinking' alcohol abuse // Alcohol Alcoholism., 2009, № 2(44). P.128-135.

References

1. Kurbat M.N., Lelevich V.V. Obmen aminokislot v golovnom mozge [Exchange of amino acids in the brain] //Neyrokhimiya [Neurochemistry] – 2009. #1(26). P.29-34. [in Russian]
2. Lakin G.F. Biometriya [Biometry]. Moscow: «Vysshaya shkola», 1990, 325 P. [in Russian]
3. Lelevich S.V. Molekulyarnyye mekhanizmy formirovaniye alkogol'noy i morfinoy intoksikatsii: Avtoref. dissertatsiya na soiskaniye uchenoy stepeni d.m.n: [Molecular mechanisms of the formation of alcohol and morphine intoxication: Abstract of dissertation for the degree  of Doctor of Medicine] - Minsk, 2015. – 47 P. [in Russian]
4. Malakhova ZH.L., Shilko V.I., Bubnov A.A. Fetal'nyy alkogol'nyy sindrom u detey rannego vozrasta, [Fetal alcohol syndrome in infants] M.: LAP Lambert Academic Publishing, 2012. - 164 P. [in Russian]
5. Nilova N.S. Ammiak i GAMK-transaminaza aktivnost' tkani golovnogo mozga [Ammonia and GABA-transaminaza activity of a fabric of a brain]. Dokl. AN SSSR, 1966, (2). P. 483-486. [in Russian]
6. Puchkov V.F. Ucheniye P.G.Svetlova o kriticheskikh periodakh razvitiya i yego znacheniye dlya sovremennoy embriologii [Doctrine P.G.Svetlova critical periods of development and its significance for modern embryolog]. Morfologiya [Morphology] - 1993, #11(105), P.147-158.
7. Dose K. Die anwendung der hochspannungspherographic dei der guantitativen totalanigse von protein hydrolysaten // Mitteiling Biochem. – 1957.- Bd. №2(329). P.416-419.
8. 8. Robert E., Frankel S. Gamma-aminobutyric acid in brain: its formation from glutamic acid // J.Biol., Chem., 1950, №1(187). P.55-63.
9. Shatunova N.F., Sytinsky I.A. On the intracellular localization of glutamate decarboxylase and gamma-amonibutyric acid in mammalian brain // J.Neurochem. – 1964. (11). P.701-708.
10. Sytinsky I.A., Priyatkina T.N. Effect of certain drugs on gamma-aminobutyric acid system on central nervous system // Biochem. Pharmacol., 1966, №1(115). P.49-57.
11. Toso L., Johnson A., Bissell S. et al. Understanding the mechanism of learning enhancement: NMDA and GABA receptor expression // American Journal of Obstetrics & Gynecology - 2007, № 3(197). P.267–277.
12. Ward R.J., Lallemand F., De Witte P. Biochemical and neurotransmitter changes implicated in alcohol-induced brain damage in chronic or 'binge drinking' alcohol abuse // Alcohol Alcoholism. - 2009, № 2(44). P.128-135.