INFLUENCE OF MUTAGENIC DRUGS ON THE FREQUENCY OF FLUCONAZOLE-RESISTANT STRAINS IN YEAST

Мазанко М.С.¹, Празднова Е.В.¹,  Чурилов М.Н.²

¹Кандидат биологических наук, ²Аспирант, Южный федеральный университет

Работа выполнена при поддержке гранта Минобрнауки РФ № 6.1202.2014/К.

ВЛИЯНИЕ ЛЕКАРСТВ-МУТАГЕНОВ НА ЧАСТОТУ ПОЯВЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНЫХ К ФЛУКОНАЗОЛУ ШТАММОВ У ДРОЖЖЕЙ

Аннотация

В статье показано, что лекарственные препараты, обладающие мутагенными свойствами: диоксидин, цисплатин, фурацилин, способны повысить уровень мутагенеза у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и привести к возникновению штаммов, обладающих резистентностью к флуконазолу.

Ключевые слова: резистентность, лекарства-мутагены, дрожжи, флуконазол.

 

Mazanko M.S.¹, Prazdnova E.V.¹, Churilov M.N.²

¹PhD in Biology, ²Postgraduate student, South Federal University

This work was supported by the Ministry of Education of the Russian Federation, grant № 6.1202.2014 / K.

INFLUENCE OF MUTAGENIC DRUGS ON THE FREQUENCY OF FLUCONAZOLE-RESISTANT STRAINS IN YEAST

Abstract

This research shows that drugs with mutageniс activity (dioxidine, cisplatin, nitrofurazone) can increase the level of mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae and induce resistance to fluconazole.

Keywords: resistance, mutagenic drugs, yeast, fluconazole.

 

Длительное и бесконтрольное применение антибиотиков в медицине, промышленности и сельском хозяйстве привело к появлению большого количества резистентных штаммов патогенных микроорганизмов: как бактерий, так и грибов. В литературе широко описаны мультирезистентные штаммы микроорганизмов и последствия, которые они вызывают, однако резистентность патогенных грибов представляет собой не меньшую проблему, чем резистентность патогенных бактерий.

Одним из решений проблемы устойчивости организмов к антибиотикам является контроль за возникновением новых резистентных штаммов.

Некоторые используемые в медицине лекарственные препараты обладают мутагенными свойствами. Как было показано в наших предшествующих работах, подобные препараты способны усиливать экспрессию бактериальных оперонов SOS-системы (Prazdnova и др., 2015), увеличивая уровень мутаций резистентности к антибиотикам (Чурилов и др., 2015). Целью данной работы было изучение влияния лекарств-мутагенов на частоту возникновения штаммов, устойчивых к антимикробным препаратам.

В качестве модельного организма был использован гаплоидный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae W303. В качестве лекарств-мутагенов были выбраны препараты, вызывавшие в наших предыдущих исследованиях ответ бактериальных оперонов SOS-системы репарации, а именно: антимикробные препараты диоксидин (предполагаемый механизм действия: активация свободнорадикальных процессов в клетке (Дурнев и д.р., 1989)) в концентрации 5000 мкг/мл и фурацилин (механизм действия: восстановление нитрогрупп молекулы за счёт ферментных систем и ДНК клетки (Коноваленко и др., 2005)) в концентрации 50 мкг/мл, а также противораковый препарат цисплатин (интеркалирующий агент, вызывает формирование внутрицепочечных аддуктов в ДНК (Novak et al., 2015))  в концентрации 50 мкг/мл.  В качестве положительного контроля был использован N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин (MNNG, алкилирующий агент, приводит к точковым мутациям в ДНК: транзициям GC-AT) в концентрации 147 мкг/мл. Подобный разброс в концентрациях был нужен для достижения сходных показателей выживаемости клеток.

 Дрожжи инкубировали двое суток в жидкой среде YPD с добавлением вышеперечисленных индукторов мутагенеза, на шейкере при температуре 25°С. После инкубации дрожжи высевали на твёрдую YPD (AYPD), содержащую 64 мкг/мл флуконазола. Согласно протоколу M-44P NCCLS дрожжи, растущие на такой концентрации флуконазола, следует считать устойчивыми к данному препарату (Balows, 2010).

Частота спонтанного мутагенеза у данного штамма составила 3*10^-3, что является достаточно высоким показателем для дрожжевых клеток. Столь высокий уровень образования устойчивости к флуконазолу может быть связан с тем фактом, что мишенью данного антигрибкового препарата является фермент ланостерол-14-α-деметилаза, и даже небольшие изменения в строении этого фермента, не снижающие жизнеспособности клеток, приводят к образованию устойчивых форм.

Выживаемость во всех исследованных случаях составляла 20-25%. Для диоксидина она составила 18%, фурацилина – 22,2%, цисплатина – 25,3%. Только в случае положительного контроля выживаемость была ниже и составила 12,5%.

Положительный контроль (MNNG) представляет собой сильный мутаген, и в использованной концентрации приводил к увеличению уровня мутагенеза в четыре раза – до 1,2*10^-2 клеток.

Присутствие в среде фурацилина увеличивало частоту образования штаммов, резистентных к флуконазолу, более, чем в два раза: до 7*10^-3 клеток. Влияние цисплатина так же увеличивало частоту образования устойчивых штаммов: до 7,1*10^-3. Однако эти значения были ниже, чем полученные при внесении в среду MNNG. Диоксидин увеличивал частоту мутаций устойчивости к флуконазолу в шесть раз – до 1,8*10^-2 клеток, что превысило значение, полученное при внесении положительного контроля. Это объясняется как значительной мутагенной активностью препарата (Сычева и др., 2004), так и высокой его концентрацией в среде.

Из представленных данных следует, что лекарства-мутагены способны увеличивать частоту мутаций клеток грибов, приводящих к появлению штаммов, резистентных к флуконазолу. Это может привести к тому, что лечение заболеваний, не связанных с патогенными и условно-патогенными грибами (например, онкологических или бактериального генеза) способно индуцировать возникновение устойчивых форм грибков и затруднить последующее лечение грибковых заболеваний человека.

Литература

1. Balows A. Manual Of Clinical Microbiology. (10th edn) / Philadelphia: Churchill Livingstone – 2000. – 143 p.
2. Сычева Л. П., Коваленко М. А., Шереметьева С. М. и др. Изучение мутагенного действия диоксидина полиорганным микроядерным методом // Бюл. эксперим. биол. мед. – 2004. – Т. 138. №. 8. – С. 188–190.
3. Prazdnova E.V., Chistyakov V.A., Mazanko M.S., Chmyhalo V.K., Churilov M.N. Determination of the specificity of ROS generation by the action of platinum-based drugs in SOS-lux test // Proceedings of the III International Sciences Congress "Problems and Prospects of Research in the Americas and Eurasia" (Buenos Aires, Argentina, 3-5 December 2014) . Buenos Aires, 2015. – P. 256-262.
4. Чурилов М. Н., Мазанко М. С., Празднова Е. В. Накопление мутаций антибиотикоустойчивости под действием лекарств-мутагенов // Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов : сборник докладов IX международной научной конференции аспирантов и студентов / ДонНТУ, ДонНУ – Донецк: ГУВЗ "ДонНТУ", 2015. – С. 405-407.
5. Дурнев, А.Д., Дубовская, О.Ю., Нигарова, Э.А., Середенин, С.Б. Роль свободных радикалов кислорода в механизме мутагенного действия диоксидина // Хим.-фарм. журн. – 1989. – Т. 23. №. 11. – С. 1289-91.
6. Коноваленко А.Б., Новиков О.О. Аналитическая характеристика лекарственных соединений группы 5-нитрофурана // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармакология. – 2005. – №1(21), вып.4.-С. 13-19.
7. Novak M, Žegura B, Baebler Š, Štern A, Rotter A, Stare K, Filipič M. Influence of selected anti-cancer drugs on the induction of DNA double-strand breaks and changes in gene expression in human hepatoma HepG2 cells // Environ Sci Pollut Res Int. – 2015 Sep 22. – pp 1-11.

 

References

1. Balows A. Manual Of Clinical Microbiology. (10th edn) / Philadelphia: Churchill Livingstone – 2000. – 143 p.
2. Sycheva L. P., Kovalenko M. A., Sheremet'eva S. M. i dr. Izuchenie mutagennogo dejstvija dioksidina poliorgannym mikrojadernym metodom // Bjul. jeksperim. biol. med. – 2004. – T. 138. №. 8. – S. 188–190.
3. Prazdnova E.V., Chistyakov V.A., Mazanko M.S., Chmyhalo V.K., Churilov M.N. Determination of the specificity of ROS generation by the action of platinum-based drugs in SOS-lux test // Proceedings of the III International Sciences Congress "Problems and Prospects of Research in the Americas and Eurasia" (Buenos Aires, Argentina, 3-5 December 2014) . Buenos Aires, 2015. – P. 256-262.
4. Churilov M. N., Mazanko M. S., Prazdnova E. V. Nakoplenie mutacij antibiotikoustojchivosti pod dejstviem lekarstv-mutagenov // Ohrana okruzhajushhej sredy i racional'noe ispol'zovanie prirodnyh resursov : sbornik dokladov IX mezhdunarodnoj nauchnoj konferencii aspirantov i studentov / DonNTU, DonNU – Doneck: GUVZ "DonNTU", 2015. – S. 405-407.
5. Durnev, A.D., Dubovskaja, O.Ju., Nigarova, Je.A., Seredenin, S.B. Rol' svobodnyh radikalov kisloroda v mehanizme mutagennogo dejstvija dioksidina // Him.-farm. zhurn. – 1989. – T. 23. №. 11. – S. 1289-91.
6. Konovalenko A.B., Novikov O.O. Analiticheskaja harakteristika lekarstvennyh soedinenij gruppy 5-nitrofurana // Nauchnye vedomosti BelGU. Ser. Medicina. Farmakologija. – 2005. – №1(21), vyp.4.-S. 13-19.7. Novak M, Žegura B, Baebler Š, Štern A, Rotter A, Stare K, Filipič M. Influence of selected anti-cancer drugs on the induction of DNA double-strand breaks and changes in gene expression in human hepatoma HepG2 cells // Environ Sci Pollut Res Int. – 2015 Sep 22. – pp 1-11.