КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В E.COLI РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА VP1 ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В E.COLI РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА VP1 ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ

Научная статья

Алиев А.С.^1, *, Грудинин М.П.², Комиссаров А.Б.³, Забродская Я.А.⁴, Шалджян А.А.⁵, Алиева А.К.⁶

^{1, 2, 3, 4} ООО «Биовет-К», Москва, Россия;

⁵ ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия;

⁶ ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный экономический университет», Санкт-Петербург, Россия

* Корреспондирующий автор (aliew.axon[at]mail.ru)

Аннотация

Оптимизированная последовательность фрагмента гена VP1 вируса инфекционной анемии цыплят клонирована в экспрессионные плазмиды pET15b и pGEX-3T в рамках считывания полигистидиновой последовательности и глутатион-S-трансферазы соответственно. Получены штаммы E. coli Rosetta(DE3), продуцирующие рекомбинантные белки 6HIS-∆VP1 и GST-∆VP1. Оптимизированы условия очистки рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1 методом металл-аффинной хроматографии и подобраны условия рефолдинга, обеспечивающие специфическое взаимодействие белка с контрольными поликлональными антителами.

Ключевые слова: (по значимости) Инфекционная анемия цыплят, ИАЦ, экспрессия генов, рекомбинантный белок VP1.

GENERATION AND CHARACTERIZATION OF THE VP1 RECOMBINANT PROTEIN OF THE CHICKEN ANEMIA VIRUS

Research article

Aliev A.S.^1, *, Grudinin M.P.², Komissarov A.B.³, Zabrodskaya Y.A.⁴, Shaldzhyan A.A.⁵, Aliyeva A. K.⁶

^{1, 2, 3, 4} LLC (limited liability company) “Biovet-K LLC”, Moscow, Russia;

⁵ Smorodintsev Research Institute of Influenza Ministry of Healthcare of the Russia, St. Petersburg, Russia;

⁶ FSBEI of HE "St. Petersburg State Economic University", St. Petersburg, Russia

* Corresponding author (aliew.axon[at]mail.ru)

Abstract

The optimized sequence of the VP1 gene fragment of the infectious chicken anemia virus was cloned into the expression vectors pET15b and pGEX-3T in-frame fused with polyhistidine and glutathione-S-transferase tags, respectively. E.coli strains Rosetta (DE3) producing recombinant 6HIS-ΔVP1 and GST-ΔVP1 proteins were obtained. The 6HIS-ΔVP1recombinant protein purification was performed using Immobilized Metal Affinity Chromatography; the refolding conditions, ensuring the specific interaction of the protein with the control polyclonal antibodies, were fulfilled.

Keywords: Chicken anemia virus, CAV, gene expression, VP1 recombinant protein. 

Введение

Возбудитель инфекционной анемии цыплят (ИАЦ) играет важную роль в инфекционной патологии птиц: активно размножаясь в гемоцитобластах костного мозга и предшественниках Т-лимфоцитов, вирус вызывает их гибель и развитие иммунодефицитного состояния [2]. У переболевшей птицы создаются условия для возникновения вторичных инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами [18]. Вирус ИАЦ относится к роду Gyrovirus семейства Circoviridae. В 2016г международным комитетом по таксономии вирусов (ICTV)  вирус ИАЦ был реклассифицирован в качестве единственного признанного члена рода Gyrovirus  семьейства Anelloviridae(Adams M. J. , et al.,2016). Вирионы цирковирусов — икосаэдрические частицы диаметром 16-25 нм. Капсид включает в себя 32 капсомера. Геном вируса ИАЦ представляет собой кольцевую одноцепочечную ДНК длиной около 2 300 нуклеотидов и кодирует три частично перекрывающихся рамки считывания (ORF1, ORF2 и ORF3). Основной структурный белок вириона VP1 (51 кДа) закодирован в ORF1 (1347 п.о.) [15], [17]. Именно этот фрагмент генома, включающий ORF1, чаще всего является объектом секвенирования и молекулярно-генетического анализа. Анализ ДНК различных штаммов, выделенных в разных регионах мира, показал, что идентичность нуклеотидных последовательностей составляет более 94 %. Это подтверждает наблюдение McNulty и соавторов [10], [11] о том, что все известные изоляты относятся к одному серотипу. Капсидный белок VP1 является одним из белковых компонентов вириона, пригодных для разработки вакцинных и диагностических препаратов [16]. В ряде работ показана возможность экспрессии генов вируса ИАЦ в клетках E.сoli, а белки, полученные подобным образом, обладают выраженной антигенной и иммуногенной активностью [7], [14]. Применение полученного в прокаритической системе экспрессии генов рекомбинантного нуклеокапсидного белка VP1 повысит специфичность и чувствительность метода иммуноферментного анализа (ИФА), используемого для выявления специфических антител.

Цель работы – получение прокариотической системы экспрессии гена VP1 вируса ИАЦ, оптимизация условий экспрессии и очистки целевого рекомбинантного белка.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и плазмиды

Для экспрессии генов, кодирующих  рекомбинантные белки, использовали штамм-реципиент Escherichia coli Rosetta (DE3) (Novagen, Германия). Плазмиды pET15b/6HIS-∆VP1 и pGEX-3T/GST-∆VP1 содержали укороченный ген, кодирующий фрагмент белка VP1 вируса инфекционной анемии цыплят (со 130 по 450 а.о.) в составе белков слияния 6HIS-∆VP1 и GST-∆VP1 соответственно. Из литературы известно, что экспрессия гена, кодирующего белок VP1 в E. coli, может быть существенно увеличена путём удаления аргинин-богатого N-концевого домена [7]. Последовательность гена VP1 штамма «ИК-4» вируса инфекционной анемии цыплят была оптимизирована без изменения его аминокислотной последовательности для экспрессии в E. coli, после чего была синтезирована в ООО «Евроген», Москва. Биологические свойства штамма «ИК-4» вируса ИАЦ, изложены в работе [1].

Трансформация клеток штамма-реципиента Escherichia coli Rosetta(DE3)

Компетентные клетки E.coli Rosetta (DE3), подготовленные согласно протоколу, изложенному в [9], помещали в ледяную баню, после чего к 100 мкл клеток добавляли раствор плазмидной ДНК (5 нг) и инкубировали на льду в течение часа. Затем клетки опускали в водяную баню при 42⁰С на 30 секунд и повторно инкубировали на льду в течение 2 минут. Далее к клеткам добавляли 400 мкл среды SOB (2% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 5M NaCl, 1M KCl), инкубировали при температуре 37⁰С на орбитальном шейкере при 220 об/мин и высевали на агаризованную среду с антибиотиком (ампициллин 100 мкг/мл и хлорамфеникол 25 мкг/мл).

Индукция экспрессии генов, кодирующих рекомбинантные белки

Для индукции экспрессии генов клетки штаммов-продуцентов E. coli Rosetta(DE3)/pGEX-3T/GST-∆VP1 и E. coli Rosetta(DE3)/ pET15b/6HIS-∆VP1 культивировали в 5 мл среды YT*2 (1.6% триптон, 1% дрожжевой экстракт, 0.5% NaCl), содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл), на орбитальном шейкере при 220 об/мин в течение 4 часов при +37⁰С до достижения оптической плотности OD=0.6. Экспрессию гена целевого белка индуцировали добавлением ИПТГ (Promega, США) до конечной концентрации 0.2 мМ. Клетки культивировали в течение 5 часов. Наличие и уровень синтеза рекомбинантных белков 6HIS-∆VP1 и GST-∆VP1 оценивали методом электрофоретического разделения белков в 12% полиакриламидном геле [6].

Накопление биомассы клеток, содержащих рекомбинантный белок

Клетки штаммов-продуцентов культивировали в 500 мл среды YT*2, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл), в течение 4 часов при +37⁰С на орбитальном шейкере при 220 об/мин до достижения оптической плотности OD=0,6. Экспрессию гена целевого белка индуцировали добавлением ИПТГ до конечной концентрации 0.2 мМ. Клетки культивировали в течение 5 часов при +37°С на орбитальном шейкере при 220 об/мин. Далее клетки осаждали центрифугированием в течение 1 часа при 9000 g и +4⁰С, ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФC-буфер: 10 мМ Na₂HPO₄, 1.8 мМ KH₂PO₄, 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl), после чего повторно осаждали центрифугированием в тех же условиях. Полученную биомассу клеток хранили при -20⁰С. Наличие целевых белков подтверждали методом электрофоретического разделения белков в 12% полиакриламидном геле.

Идентификация рекомбинантных белков методом MALDI масс-спектрометрии

Лизаты клеток штаммов-продуцентов подвергали электрофоретическому разделению в 12% полиакриламидном геле по методике Лэммли [6] на аппарате MiniProtean III с использованием коммерческих гелей MiniProtean TGX StainFree (Bio-Rad). Гели окрашивали коллоидным раствором Кумасси G-250 [3], изображения получали на аппарате ChemiDoc XRS+ и анализировали при помощи программного обеспечения ImageLab (Bio-Rad). Окрашенные зоны, предположительно соответствующие целевым белкам GST-∆VP1 и 6HIS-∆VP1, вырезали и проводили ферментативный гидролиз белков в геле трипсином. Для этого вырезанные зоны отмывали два раза по 15 минут в 100 мкл 40% ацетонитрила, 30 мM NH₄HCO₃ и обезвоживали 100 мкл 100% ацетонитрила, после чего к сухому фрагменту геля добавляли 2 мкл трипсина (Sigma, США), 20 мкг/мл в 50 мM NH₄HCO₃. Ферментативный гидролиз проводили в течение 5 часов при температуре +37⁰C. Реакцию останавливали 3 мкл 10% ацетонитрила, 0.5% трифторуксусной кислоты.

Для масс-спектрометрического исследования образец смешивали с матрицей DHB (2,5-дигидроксибензойная кислота, Bruker, Германия) и наносили на мишень GroundSteel (Bruker, Германия). Спектр триптических пептидов получали на MALDI-TOF/TOF масс-спектрометре «ultrafleXtreme» (Bruker, Германия) в режиме регистрации положительных ионов. Идентификацию белка осуществляли с использованием Mascot (matrixscience.com). Поиск проводился одновременно среди всех известных белков в базе данных NCBI (национальный центр биотехнологической информации, США) и в локальной базе данных, куда вносили оригинальные последовательности рекомбинантных белков. В качестве вариабельных модификаций а.о. указывали окисление метионинов, ошибку ограничивали 20  ppm.

Очистка рекомбинантных белков

Выделение телец включения

Биомассу размораживали, ресуспендировали в лизирующем буфере (50 мМ трис-HCl, 500 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 1 мМ фенилметилсульфанил фторид (ФМСФ), 5 мМ β-меркаптоэтанол, pH 8.0) из расчета 2 мл буфера на 1 г биомассы. Далее клетки разрушали, подвергая суспензию обработке ультразвуком при помощи дезинтегратора MSE (Великобритания) (5 циклов по 30 секунд озвучивания и 2 минуты охлаждения в ледяной бане). Полученные лизаты центрифугировали в течение 1 часа при 15000 g, +4⁰С, супернатант отбрасывали. Осадок ресуспендировали в лизирующем буфере (см. выше) из расчета 1 мл буфера на 1 г осадка, центрифугировали в течение 1 часа при 30000 g, +10⁰С. Супернатант отбрасывали, полученные осадки, содержащие тельца включения целевых белков GST-∆VP1 и 6HIS-∆VP1, хранили при -20⁰С.

Хроматографическая очистка и рефолдинг целевых белков

Рекомбинантный белок GST-∆VP1

Тельца включения растворяли в денатурирующем буфере (ФС-буфер, 8 М мочевина, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ ФМСФ) из расчета 5 мл буфера на 1 г телец включения. Раствор инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение 1 часа, далее центрифугировали при 30000 g, +10⁰С в течение 1 часа. Супернатант отбирали, фильтровали через шприцевой фильтр-насадку (Millipore, размер пор 0.45 мкм, материал мембраны – полиэфирсульфон). Концентрацию белка в растворе определяли методом Лоури [8].

Рефолдинг белка проводили методом разбавления. Раствор телец включения приливали к предварительно охлаждённому буферу для рефолдинга (ФС-буфер, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ ФМСФ) до конечной концентрации белка 0.1 мг/мл и инкубировали на магнитной мешалке в течение 24 часов при температуре +4⁰C. Далее раствор центрифугировали в течение 1 часа при 15000 g, +4⁰C, супернатант отбирали, определяли концентрацию белка методом Лоури.

Хроматографическую очистку проводили методом аффинной хроматографии на иммобилизованном глутатионе. Хроматографическую колонку GSTrap HP (GE Healthcare, США) объемом 5 мл уравновешивали 25 мл стартового буфера (ФС-буфер, 2 мМ ЭДТА) на скорости потока 5 мл/мин. Далее вносили раствор белка после рефолдинга на скорости потока 2 мл/мин, после чего промывали колонку 50 мл стартового буфера на скорости потока 2 мл/мин. Целевой белок элюировали буфером для элюции (100 мМ трис-HCl, 20 мМ восстановленный глутатион, pH 7.8) на скорости потока 2 мл/мин. Мониторинг элюции вели по оптической плотности на длине волны 280 нм, отбирая фракции объемом 1 мл при помощи автоматического коллектора.

Рекомбинантный белок 6HIS-∆VP1

Тельца включения растворяли в денатурирующем буфере (20 мМ Na₃PO₄, 500 мМ NaCl, 8 М мочевина, 20 мМ имидазол, 1 мМ ФМСФ, 5 мМ β-меркаптоэтанол, pH 7.4) из расчета 5 мл буфера на 1 г телец включения. Раствор инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение 1 часа, далее центрифугировали в течение 1 часа при 30000 g, +10⁰С. Супернатант отбирали, фильтровали через шприцевой фильтр-насадку (размер пор 0.45 мкм, материал мембраны – полиэфирсульфон). Полученный солюбилизат телец включения хранили при +4^оС не более 24 часов с добавлением ФМСФ до конечной концентрации 1 мМ.

Хроматографическую очистку проводили методом металл-аффинной хроматографии. Хроматографическую колонку HisTrap FF Crude (GE Healthcare, США) объемом 5 мл перед нанесением образца промывали 25 мл буфера для нанесения (20 мМ Na₃PO₄, 500 мМ NaCl, 8 М мочевина, 20 мМ имидазол, pH 7.4) на скорости потока 5 мл/мин. Далее вносили солюбилизат телец включения на скорости потока 5 мл/мин, после чего колонку промывали 75 мл буфера для нанесения на скорости потока 5 мл/мин. Целевой белок элюировали буфером для элюции (20 мМ Na₃PO₄, 500 мМ NaCl, 8 М мочевина, 500 мМ имидазол, pH 7.4) на скорости потока 2 мл/мин. Мониторинг элюции вели по оптической плотности на длине волны 280 нм, отбирая фракции объемом 1 мл при помощи автоматического коллектора. Фракции, имеющие значение оптической плотности более 300 mAU, объединяли.

Рефолдинг очищенного белка 6HIS-∆VP1 осуществляли методом разбавления. К предварительно охлажденному до +4⁰С буферу для рефолдинга (см. рис. 6) приливали раствор очищенного белка до конечной концентрации белка 0.1 мг/мл и инкубировали на шейкере в течение 24 часов при +4⁰С. Далее полученный раствор белка центрифугировали в течение 1 часа при 15000g, +4^оС, супернатант отбирали, концентрацию белка определяли методом Лоури.

Оценка эффективности рефолдинга

Эффективность рефолдинга белков определяли методом электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле с последующей денситометрией. Супернатант после рефолдинга и контрольный образец (раствор телец включения белка, разбавленный денатурирующим буфером до конечной концентрации белка 0.1 мг/мл) анализировали по методике Лэммли на аппарате MiniProtean III с использованием коммерческих гелей MiniProtean TGX StainFree (Bio-Rad). Гели окрашивали коллоидным раствором Кумасси G-250 [3], изображения получали на аппарате ChemiDoc XRS+ и анализировали при помощи программного обеспечения ImageLab (Bio-Rad). Процент целевого белка в растворимой форме вычисляли, проводя сравнительную денситометрию дорожек исследуемого образца и образца сравнения.

Метод непрямого иммуноферментного анализа (ИФА)

Постановку непрямого ИФА проводили по следующей схеме. Рекомбинантный антиген в концентрации 5 мкг/мл сорбировали на планшетах для иммуноферментного анализа (Медполимер, Россия) в 0.05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9.5, в течение 18 часов при 4⁰С, промывали ФС-буфером, содержащем 0.05% Твин-20, (ФСБТ) и высушивали при 37⁰С. В качестве блокирующего раствора использовали 5% обезжиренное молоко в ФС-буфере. Далее в лунки последовательно вносили по 100 мкл исследуемых сывороток (использовали серию двукратных разведений 1:100, 1:200 и т.д.) в ФСБТ, а затем меченые пероксидазой антитела к IgY кур в рабочем разведении. В качестве контроля также вносили по 100 мкл положительной и отрицательной сыворотки. На каждом этапе планшеты инкубировали 1 час с последующей трехкратной отмывкой ФСБТ. Далее в лунки вносили по 100 мкл субстратного раствора с тетраметилбензидином («ТМБ», «Sigma») и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 0.05 мл 2 M H₂SO₄. Интенсивность окраски в лунках определяли на планшетном фотометре Multiskan EX (Thermo Scientific, США) при длине волны 450 нм (А450). Положительными считали сыворотки со значением А450 в два и более раза превышающие значения А450 отрицательной сыворотки.

Результаты и обсуждение

Конструирование экспрессионных плазмид

Для разработки эффективной технологии получения и очистки фрагмента белка VP1 вируса инфекционной анемии цыплят использовали две генетические конструкции, которые кодируют два рекомбинантных белка. В рекомбинантном белке GST-∆VP1 целевой белок ∆VP1 маркирован глутатион-S-трансферазой, а рекомбинантном белке 6HIS-∆VP1 целевой белок ∆VP1 маркирован 6HIS-тегом, расчетная молекулярная масса белков составляет 63.6 и 41.0 кДа соответственно.На первом этапе исследования последовательность гена VP1 клонировали в экспрессионные векторы pGEX-3T и pET15b по сайтам рестрикции BamHI/EcoRI и NdeI/XhoI соответственно. В результате получили конструкции pGEX-3T/GST-∆VP1 и pET15b/6HIS-∆VP1, кодирующие рекомбинантные белки GST-∆VP1 и 6HIS-∆VP1 (см. рис. 1).

Рис. 1 – Схема строения рекомбинантных белков. a) VP1 дикого типа, красным отмечен участок с 1 по 129 а.о., обогащенный аргинином; б) рекомбинантный белок GST-∆VP1, содержащий протеолитический тромбиновый сайт (ТТТ); в) рекомбинантный белок 6HIS-∆VP1, содержащий протеолитический тромбиновый сайт (ТТТ)

 

Затем отбирали клоны клеток, в которых выявили экспрессию созданных генетических конструкций (рис.2, дорожки 2-4 и рис. 3, дорожки 2-7).

Рис. 2 – Электрофореграмма лизата клеток E.coli Rosetta (DE3) трансформированных плазмидой pGEX-3T/GST-∆VP1:

дорожка М – маркер молекулярных масс;

дорожка 1 – лизат клеток до индукции;

дорожки 2, 3, 4 – лизат клеток после индукции и 5 часов культивирования;

* – зона, по электрофоретической подвижности соответствующая рекомбинантному белку GST-∆VP1 с молекулярной массой 63.6 кДа

Рис. 3 – Электрофореграмма лизата клеток E.coli Rosetta (DE3) трансформированных плазмидой pET15b/6HIS-∆VP1: дорожка М – маркер молекулярных масс; дорожка 1 – лизат клеток до индукции;  дорожки 2, 3, 4, 5 и 6 – лизат клеток после индукции и 5 ч культивирования; * – зона, по электрофоретической подвижности соответствующая рекомбинантному белку 6HIS-∆VP1 с молекулярной массой 41.0 кДа

В ходе исследований установили, что рекомбинантные белки накапливаются в клетках в форме телец включения (данные не представлены).

Таким образом, рекомбинантные белки в клетках штаммов-продуцентов E. coli Rosetta(DE3)(pGEX-3T/GST-∆VP1) и E. coli Rosetta(DE3)(pET15b/6HIS-∆VP1) накапливаются в состоянии, не обладающим нативной пространственной структурой, в функционально не активной форме. В связи с этим на следующем этапе исследования осуществили подбор условий рефолдинга для перевода белков в нативное состояние, то есть в активную форму, а также оптимизировали метод их очистки.

Рекомбинантный белок GST-VP1

Методом MALDI масс-спектрометрии в образце, содержащем рекомбинантный белок GST-VP1, достоверно идентифицировали белок слияния GST-VP1 [chicken anemia virus]. Величина Score составила 551 при пороговом значении 89 (в случае, если Score превышает пороговое значение, идентификация считается достоверной, p < 0.05).

Эксперименты по оптимизации условий рефолдинга белка слияния GST-VP1 показали, что изменение состава буфера для рефолдинга не оказывает существенного влияния как на выход растворимой формы белка, так и на эффективность его связывания с иммобилизованным глутатионом (данные не представлены). Аффинная хроматография GST-меченого белка на иммобилизованном глутатионе (колонке GSTrap HP) оказалась невозможной для растворимой формы белка GST-∆VP1 после рефолдинга. Причиной этого может являться как некорректный фолдинг глутатион-связывающего сайта, так и его экранирование элементами пространственной структуры рекомбинантного белка. В обоих случаях хроматографическая очистка на иммобилизованном глутатионе оказывается неэффективной.

Таким образом, синтезировали целевой продукт, меченый GST, но не способный взаимодействовать с иммобилизованным глутатионом. Однако, не удалось подобрать условия, обеспечивающие связывание рекомбинантного белка GST-VP1 с иммобилизованным глутатионом.

Рекомбинантный белок 6HIS-∆VP1

Методом MALDI масс-спектрометрии в образце, содержащем рекомбинантный белок 6HIS-∆VP1, достоверно идентифицировали белок слияния 6HIS-∆VP1 [chicken anemia virus]. Величина Score составила 233 при пороговом значении 70 (в случае, если Score превышает пороговое значение, идентификация считается достоверной, p < 0.05) (рис.4 и табл.1). На рисунке 4 представлен фрагмент масс-спектра рекомбинантного белка, на котором отмечены зарегистрированные ионы и номера аминокислотных остатков в последовательности, которым они соответствуют. Таким образом, синтезировали целевой продукт, меченый полигистидиновой последовательностью.

Рис. 4 – Фрагмент MALDI масс-спектра рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1

Примечание: Отмечены ионы, найденные в последовательности белка. Указаны их m/z и номера соответствующих им аминокислотных остатков

 

В таблице 1 представлена аминокислотная последовательность рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1, подчёркнуты фрагменты, обнаруженные в ходе масс-спектрометрического анализа. Покрытие последовательности составило 47%.

 

Таблица 1 – Фрагменты аминокислотной последовательности рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1, обнаруженные в ходе масс-спектрометрического анализа

1	AGELIADGSQ	SQAAQNWPNC	WLPLDNNVPS	ATPSAWWRWA	LMMMQPTDSC
51	RFFNHPKQMT	LQDMGRMFGG	WHLFRHIETR	FQLLATKNEG	SFSPVASLLS
101	QGEYLTRRDD	VKYSSDHQNR	WRKGEQPMTG	GIAYATGKMR	PDEQQYPAMP
151	PDPPIITATT	AQGTQVRCMN	STQAWWSWDT	YMSFATLTAL	GAQWSFPPGQ
201	RSVSRRSFNH	HKARGAGDPK	GQRWHTLVPL	GTETITDSYM	SAPASELDTN
251	FFTLYVAQGT	NKSQQYKFGT	ATYALKEPVM	KSDAWAVVRV	QSVWQLGNRQ
301	RPYPWDVNWA	NSTMYWGSQP	HHHHHH

 

В отличие от аффинной хроматографии на иммобилизованном глутатионе, металл-аффинная хроматография, использующаяся для очистки гистидин-меченых белков, позволяет проводить процесс как в нативных, так и в денатурирующих условиях, что в большинстве случаев обеспечивает решение проблем, связанных с экранированием аффинной метки. Металл-аффинную хроматографию в денатурирующих условиях использовали для очистки рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1 (рис. 5). Пул фракций, содержащий целевой белок, диализовали против 50 мМ натрий-фосфатного буфера, pH 7.4, содержащего 1 мМ ЭДТА и 8 М мочевину, и хранили при -20⁰С.

Рис. 5 – Хроматограмма очистки рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1 на колонке HisTrap FF Crude.

1 – фракция не связавшегося материала; 2 – фракция элюата.

Примечание: синим цветом показана оптическая плотность на длине волны 280 нм

 

Для изучения биологических свойств очищенного рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1 оптимизировали условия рефолдинга данного белка с оценкой количества растворимой формы белка. Для этого использовали буферные растворы, содержащие различные концентрации стабилизирующих агентов и неионных поверхностно активных веществ, имеющие различные значения ионной силы и pH среды. Для рефолдинга использовали 100 мкл белка в концентрации 2 мг/мл в 1.9 мл каждого из испытуемых растворов, после чего измеряли фактическую концентрацию белка методом Лоури с последующим электрофоретическим разделением белков в полиакриламидном геле по методу Лэммли и денситометрией для оценки содержания белка в растворимой форме. На рисунке 6 представлены результаты эксперимента по рефолдингу целевого белка в девяти различных буферных растворах.

Рис. 6 – Рефолдинг рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1 в различных буферных системах

 

Наибольший выход белка 6HIS-∆VP1 в растворимой форме получили с использованием трёх буферных систем: 50 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 5.5, содержащий 0.1% Твин-20 (85% белка в растворимой форме); фосфатно-солевой буфер, pH 7.4, содержащий 0.5 М L-аргинин (60% белка в растворимой форме) и 50 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 5.5 (55% белка в растворимой форме). Однако методом ИФА показали, что только в фосфатно-солевом буфере, pH 7.4, содержащем 0.5 М L-аргинин, рефолдинг рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1 обеспечил его специфическое взаимодействие с поликлональными антителами сывороток кур (рис. 7).

Для подтверждения специфического взаимодействия растворимой формы очищенного рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1 использовали положительный и отрицательный контрольные сыворотки крови из набора BioCheck CAV Antibody test kit (BioCheck, США). Рекомбинантный белок 6HIS-∆VP1 сорбировали на 96-луночный планшет Nunc MaxiSorp (ThermoFisher, США) в концентрации 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313 и 0.156 мкг/мл. Далее проводили ИФА с использованием реагентов из набора BioCheck согласно инструкции производителя. Результаты документировали при помощи планшетного фотометра Multiskan EX (Thermo Scientific, США). На рисунке 7 показана корреляция (зависимость) среднего значения оптической плотности контрольных образцов от концентрации рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1.

 

Рис. 7 – Антигенная активность растворимой формы очищенного белка 6HIS-∆VP1: положительный контрольный образец – сыворотка крови птиц, содержащая антитела к возбудителю инфекционной анемии; отрицательный контрольный образец – сыворотка крови СПФ кур

 

На следующем этапе работы для определения возможности выявления антител к вирусу ИАЦ в сыворотках крови зараженных птиц использовали метод ИФА. В качестве антигена в лунки микропланшета сорбировали рекомбинантный белок 6HIS-∆VP1. Для выявления антител использовали полевые сыворотки крови и сыворотки крови СПФ-цыплят, заражённых патогенным штаммом «ИК-4» вируса ИАЦ, а также сыворотки крови контрольной группы цыплят. Суточным СПФ-цыплятам (n=10) внутримышечно вводили 0.1 мл патогенного штамма «ИК-4» в дозе 6.4 ДНК коп/мл. Контрольной группе (n=5) вводили 0.1 мл физиологического раствора. Сыворотки крови для изучения методом ИФА получали до заражения, затем на 21, 28, 35, 42 и 48 сутки после заражения. Результаты эксперимента приведены в таблице 2 и на рисунке 8 соответственно.

 

Таблица 2 – Результаты исследования методом ИФА сывороток крови цыплят на наличие антител к вирусу ИАЦ

Возраст (сут)	Количество проб	Титр антител
		0	200	400-800	800-1600	3200-6400
1 21 35	61 65 94	16 18 0	10 15 16	12 20 18	18 12 34	5 0 26

 

Рис. 8 – Динамика накопления антител в сыворотке крови СПФ-цыплят, зараженных штаммом «ИК-4» вируса ИАЦ

Данные, приведенные в таблице 2 и на рисунке 8, свидетельствуют о том, что рекомбинантный белок VP1 пригоден для выявления антител к вирусу ИАЦ в сыворотке кровы птиц, больных ИАЦ.

Предварительно методом «шахматного» титрования определяли концентрацию рекомбинантного белка и рабочее разведение иммунопероксидазного конъюгата к IgG кур (ООО «ИМТЕК», г.Москва) путем постановки непрямого ИФА, используя двукратные последовательные разведения препаратов. За рабочее разведение каждого из компонентов принимали предельное разведение каждого, обеспечивающее ОП=1.0 ед.

Для определения пороговой чувствительности ИФА устанавливали зависимость величины ОП₄₅₀ продукта реакции от разведения положительной и отрицательной сывороток. Двукратные разведения положительной и отрицательной сыворотки начинали с разведения 1:100. Опыт проводили при оптимальной концентрации сорбированного рекомбинантного антигена. Достоверно регистрируемое различие в показаниях ОП₄₅₀ (более чем в 2 раза) наблюдали при разведении положительной и отрицательной сывороток, начиная с 1:200 и более. При разведении ниже 1:200 регистрировали неспецифическое взаимодействие, что не позволяло адекватно оценить результаты реакции.

Таким образом, были определены оптимальная концентрация рекомбинантного антигена для сорбции и разведение положительной сыворотки, которые могут быть использованы при постановке ИФА для выявления специфических антител к вирусу ИАЦ.

Специфичность метода определяли с использованием иммунных сывороток птиц к вирусам инфекционного бронхита, ньюкаслской болезни, инфекционного ларинготрахеита, аденовирусной инфекции, Mycoplasma gallisepticum, а также отрицательную сыворотку кур. Отсутствие положительной реакции с нормальной сывороткой и сыворотками к гетерологичным возбудителям птиц свидетельствует о специфичности рекомбинантного антигена.

Заключение

При выполнении данной работы оптимизировали метод очистки рекомбинантного белка 6HIS-∆VP1 и подобрали условия рефолдинга, обеспечивающие антигенную активность его растворимой формы. Полученный рекомбинантный белок 6HIS-VP1 пригоден для выявления антител к вирусу инфекционной анемии цыплят и может рассматриваться как потенциальный компонент вакцины против данного вируса, что является предметом наших дальнейших исследований.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Алиев А.С. Патогенность изолятов вируса инфекционной анемии цыплят / Алиев А.С., Бурлаков М.В., Громов И.Н. // Ветеринария. – 2015. – No. 5. – c. 20-24.
2. Adams M. J. Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses / Adams M. J, E. J. Lefkowitz, A. M. Q. King and others (2016). Arch. Virol. 161:2921–2949.
3. Adair B. Immunopathogenesis of chicken anemia virus infection / Adair B. // Dev.Comp. Immunol. – 2000. – No. 24. – pp. 247–255.
4. Candiano G. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis / Candiano G., Bruschi M., Musante L. and others // Electrophoresis. – 2004. – Vol.25 – No. 9. – pp.1327-1333.
5. Ducatez M.F. Molecular epidemiology of chicken anemia virus in Nigeria / Ducatez M.F., Owoade A.A., Abiola J.O. and others // Arch. Virol. – 2006. – No. 151. – pp. 97 – 111.
6. Kumar S. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets / Kumar S., Stecher G., Tamura K. // Molecular Biology and Evolution // 2016. – No. 33. – pp. 1870-1874.
7. Laemmli U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 / Laemmli U. K. // Nature – Vol. 227. – pp. 680–685. doi :10.1038/227680a0.
8. Lee M.S. Production of chicken anemia virus (CAV) VP1 and VP2 protein expressed by recombinant Escherichia coli / Lee M.S., Lien Y.Y., Feng S.H. and others // Process Biochem. – 2009. – No. 44. pp. 390-395.
9. Lowry O.H. Protein Measurement with the Fooling Phenol Reagent / Lowry O.H., Rosebrough N. J., Farr A. L. and others // J. Biol. Chem. – – No.193. – pp. 265–275.
10. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. / Maniatis T., Sambrook J., Fritsch E.F. // Cold Spring Harbor Laboratory Press. – 1982.
11. McNulty M.S. Chicken anemia agent in the United States: isolation of the virus and detection of antibody in broiler breeder flocks / McNulty M.S., Connor T.J., McNeilly F. and others // Avian Diseases. – 1989. – Vol. 33. – pp. 691-694.
12. McNulty M. S. Preliminary characterization of isolates of chicken anaemia agent from the United Kingdom. / McNulty M. S., Connor T. J., McNeilIy F. and others // Avian Pathology. – 1990. – Vol. 19. – pp. 67-73.
13. Natesan S. Biological and molecular characterization of chicken anaemia virus isolates of Indian origin / Natesan S., Kataria J., Dhama K. and others // Virus Res. – 2006. – No. 118. – pp. 78–86.
14. Nayabian H. Molecular characterization of the chicken anaemia viruses isolated from broiler farms of west Azerbaijan, Iran / Nayabian H., Mardani K. // Avian Pathology. – 2013. – Vol. 42. – pp. 108-113.
15. Pallister R.J. Cloning and sequencing of the chicken anemia virus (CAV) ORF-3 gene, and the development of an ELISA for the detection of serum antibody to CAV / Pallister R.J., Fahey K.J., Sheppard M. // Veterinary Microbiology. – 1994. – No. 39. – pp. 167-178.
16. Pringle C.R. Virus Taxonomy at the XIth International Congress of Virology. Sydney, Australia / Pringle C.R. // Archives of Virology. – 1999. – No. 144. – pp. 2065 – 2070.
17. Renshaw R.W. A hypervariable region in VP1 of chicken infectious anemia virus mediates rate of spread and cell tropism in tissue culture / Renshaw R.W., Soine C., Weinkle T. and others // J. Virol. – 1996. – No. 70. – pp. 8872–8878.
18. Phenk K.V. Transcriptional analysis and genome expression of chicken anemia virus / Phenk K.V., Meehan B.M., Todd D. and others // Journal of General Virology. – No. 75. – pp. 905-909.
19. Тodd D. Circoviruses: Immunosuppressive threat to avian species; a review / Тodd D. // Avian Pathology. – 2000. – No. 29. – pp. 373 – 394.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Aliev A.S. Patogennost' izolyatov virusa infekcionnoj anemii cyplyat [Pathogenicity of chicken infectious anemia virus isolates] / Aliev A.S., Burlakov M.V., Gromov I.N. // Veterinariya. – 2015. – No. 5. – p. 20-24. [in Russian]
2. Adams M. J. Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses / Adams M. J, E. J. Lefkowitz, A. M. Q. King and others (2016). Arch. Virol. 161:2921–2949.
3. Adair B. Immunopathogenesis of chicken anemia virus infection / Adair B. // Dev.Comp. Immunol. – 2000. – No. 24. – pp. 247–255.
4. Candiano G. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis / Candiano G., Bruschi M., Musante L. and others // Electrophoresis. – 2004. – Vol.25 – No. 9. – pp.1327-1333.
5. Ducatez M.F. Molecular epidemiology of chicken anemia virus in Nigeria / Ducatez M.F., Owoade A.A., Abiola J.O. and others // Arch. Virol. – 2006. – No. 151. – pp. 97 – 111.
6. Kumar S. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets / Kumar S., Stecher G., Tamura K. // Molecular Biology and Evolution // 2016. – No. 33. – pp. 1870-1874.
7. Laemmli U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 / Laemmli U. K. // Nature – Vol. 227. – pp. 680–685. doi :10.1038/227680a0.
8. Lee M.S. Production of chicken anemia virus (CAV) VP1 and VP2 protein expressed by recombinant Escherichia coli / Lee M.S., Lien Y.Y., Feng S.H. and others // Process Biochem. – 2009. – No. 44. pp. 390-395.
9. Lowry O.H. Protein Measurement with the Fooling Phenol Reagent / Lowry O.H., Rosebrough N. J., Farr A. L. and others // J. Biol. Chem. – – No.193. – pp. 265–275.
10. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. / Maniatis T., Sambrook J., Fritsch E.F. // Cold Spring Harbor Laboratory Press. – 1982.
11. McNulty M.S. Chicken anemia agent in the United States: isolation of the virus and detection of antibody in broiler breeder flocks / McNulty M.S., Connor T.J., McNeilly F. and others // Avian Diseases. – 1989. – Vol. 33. – pp. 691-694.
12. McNulty M. S. Preliminary characterization of isolates of chicken anaemia agent from the United Kingdom. / McNulty M. S., Connor T. J., McNeilIy F. and others // Avian Pathology. – 1990. – Vol. 19. – pp. 67-73.
13. Natesan S. Biological and molecular characterization of chicken anaemia virus isolates of Indian origin / Natesan S., Kataria J., Dhama K. and others // Virus Res. – 2006. – No. 118. – pp. 78–86.
14. Nayabian H. Molecular characterization of the chicken anaemia viruses isolated from broiler farms of west Azerbaijan, Iran / Nayabian H., Mardani K. // Avian Pathology. – 2013. – Vol. 42. – pp. 108-113.
15. Pallister R.J. Cloning and sequencing of the chicken anemia virus (CAV) ORF-3 gene, and the development of an ELISA for the detection of serum antibody to CAV / Pallister R.J., Fahey K.J., Sheppard M. // Veterinary Microbiology. – 1994. – No. 39. – pp. 167-178.
16. Pringle C.R. Virus Taxonomy at the XIth International Congress of Virology. Sydney, Australia / Pringle C.R. // Archives of Virology. – 1999. – No. 144. – pp. 2065 – 2070.
17. Renshaw R.W. A hypervariable region in VP1 of chicken infectious anemia virus mediates rate of spread and cell tropism in tissue culture / Renshaw R.W., Soine C., Weinkle T. and others // J. Virol. – 1996. – No. 70. – pp. 8872–8878.
18. Phenk K.V. Transcriptional analysis and genome expression of chicken anemia virus / Phenk K.V., Meehan B.M., Todd D. and others // Journal of General Virology. – No. 75. – pp. 905-909.
19. Тodd D. Circoviruses: Immunosuppressive threat to avian species; a review / Тodd D. // Avian Pathology. – 2000. – No. 29. – pp. 373 – 394.