ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЦИТОКИНЫ И МАРКЕРЫ АПОПТОЗА ПРИ ЯЗВЕННОМ КОЛИТЕ: ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

Павленко В.В.¹, Катаганова Г.А.², Александрова С.Б.³, Кораблина Н.В.⁴, Павленко А.И.⁵

¹Доктор медицинских наук, ^2,3,4Кандидат медицинских наук, ⁵Студент, Ставропольский государственный медицинский университет

ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЦИТОКИНЫ И МАРКЕРЫ АПОПТОЗА  ПРИ ЯЗВЕННОМ КОЛИТЕ: ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

Аннотация

Изучен уровень синтеза провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ФНО-α) и экспрессии маркеров апоптоза (CD-95-L, Bcl-2) лимфоцитами периферической крови у больных с тяжелым ЯК на фоне индукционного курса биологическим препаратом  инфликсимабом. Полученные результаты свидетельствуют о исходно высокой продукции иммунокомпетентными клетками крови провоспалительных медиаторов, в частности, ФНО-α и ИЛ-1β,  и нарушением процесса апопотоза при тяжелом течении ЯК. Использование ингибитора ФНО-α - инфликсимаба способствует нарастанию апоптотической готовности лимфоцитов, нормализации продукции ИЛ-1β и снижению синтеза  ФНО-α мононуклеарами периферической кров, что сочетается с позитивной динамикой заболевания.

Ключевые слова:  язвенный колит, цитокины, апоптоз, инфликсимаб.

Pavlenko V.V.¹, Kataganova G.A.², Aleksandrova S.B.³, Korablina N.V.⁴, Pavlenko A.I.⁵

¹Doctor of Medical Sciences, ^2,3,4Candidate of Medical Sciences, ⁵Student, Stavropol State Medical University

PROINFLAMMATORY CYTOKINES AND APOPTOSIS MARKERS IN ULCERATIVE COLITIS: INFLUENCE OF BIOLOGICAL THERAPY

Abstract

Examine the level of synthesis of pro-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α) and the expression of markers of apoptosis (CD-95-L, Bcl-2) peripheral blood lymphocytes in patients with severe UC in the background induction biologic course of infliximab. The results show high initial production by immunocompetent cells of blood pro-inflammatory mediators, including TNF-α and IL-1β, and a violation of apoptosis in severe UC. Use of TNF-α- inhibitor - Infliximab contribute to increasing readiness apoptotic lymphocytes, the normalization of the production of IL-1β and reduce the synthesis of TNF-α peripheral blood mononuclear cells, combined with the positive dynamics of the disease.

Key words: ulcerative colitis, cytokines, apoptosis, infliximab.

В настоящее время язвенный колит (ЯК) является одной из наиболее серьёзных проблем гастроэнтерологии, что в значительной мере предопределено неизвестной этиологией, сложностью патогенеза, рецидивирующим характером течения, опасными для жизни осложнениями и малоэффективным лечением [1,2]. Существует значительное число исследований, свидетельствующих о том, что в патогенезе ЯК участвует множество факторов: генетические, факторы окружающей среды, компоненты кишечной микрофлоры, иммунная система [4,9]. Выполненные к настоящему времени исследования раскрывают лишь отдельные стороны регуляции иммуновоспалительной реакции в слизистой оболочке кишечника при данной патологии. Персистенция иммуновоспалительного процесса в толстой кишке при ЯК может быть связана с избыточной продукцией провоспалительных цитокинов иммунными клетками (ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО-α и др.) в результате нарушений в механизмах апоптоза. Реализация апоптоза происходит через специфические рецепторы, относящиеся к семейству ФНО – (Fas) и семейству Bcl-2-генов [3,5].

Более глубокое понимание патогенеза ЯК привело к появлению новых терапевтических стратегий. Одна из них состоит в целенаправленном воздействии биологическими препаратами на провоспалительные цитокины (ФНО-α), некоторые молекулы,  регулирующие взаимодействие между лейкоцитами и эндотелиальными клетками в зоне воспаления (преимущественно лейкоцитарные интегрины и эндотелиальные молекулы клеточной адгезии суперсемейства иммуноглобулинов) [2, 7].

Цель исследования: изучить влияние инфликсимаба на синтез провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ФНО-α) и уровень апоптоза (CD-95-L, Bcl-2) у больных с тяжелым ЯК.

Материал и методы исследования: обследовано  55 пациентов с тяжелым течением и высокой степенью клинической активности ЯК (индекс Рахмилевича 16-30 баллов). Инфликсимаб (Ремикейд) назначали по индукционной схеме (3 введения) в дозе 5 мг/кг массы тела на фоне предшествующей иммуносупрессивной терапии (азатиоприн, преднизолон). Все пациенты были респондерами на эту терапию.

Экспрессию маркеров апоптоза CD-95-L и Bcl-2 лимфоцитами периферической крови исследовали на  проточном цитометре Facs Callibur (USA). Результат выражали в % клеток, экспрессирующих изучаемый маркер. Контрольную группу  составили 20 практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту. Количество лимфоцитов, экспрессирующих CD-95-L в контрольной группе составило 11,05±0,7%,  Bcl-2 – 55,87±4,9%.        Содержание цитокинов – ИЛ-1β и ФНО-α в супернатантах клеток в спонтанных и индуцированных ЛПС условиях определяли методом ИФА с помощью стандартных тест-систем фирмы «Цитокин» (Россия). Результаты выражали в нг/2х10⁶ клеток. МНК выделяли из крови, стандартизировали, определяли спонтанную и ЛПС-стимулированную продукцию цитокина. Продукция ФНО-α МНК в контрольной группе составила: спонтанная – 1,54±0,9 и ЛПС-стимулированная - 2,81±0,21 нг/2х10⁶; продукция ИЛ-1β - спонтанная – 0,9±0,1нг/2х10⁶ и ЛПС-стимулированная - 1,25±0,1нг/2х10⁶ .

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием персонального компьютера на базе процессора "Pentium III", с помощью пакета программ "Excel", "Biostat", "Statistica 6" используя непараметрический критерий Манна-Уитни и парный t критерий Стьюдента для выборок с односторонним распределением и неравными дисперсиями, точный критерий Фишера. Статистически достоверными считали различия при Р <0,05.

Результаты и обсуждение. Установлено, что в период выраженной активности ЯК исходное количество лимфоцитов, экспрессирующих Bcl-2 (71,8±1,9%, Р<0,05 с контролем) повышено, а экспрессия CD-95-L (5,9±1,9%, Р<0,05 с контролем), наоборот, снижена. Исходный спонтанный и стимулированный синтез ФНО-α  и ИЛ-1β мононуклеарами (МНК) больных активным ЯК был значительно выше контрольных значений (спонтанная – 5,9±0,8 и 1,85±0,04, стимулированная - 8,2±0,9 и 6,3±0,45 нг/2х10⁶ клеток, соответственно, Р<0,05 с контролем). После трехкратного внутривенного введения Ремикейда отмечалось нормализация синтеза ИЛ-1β МНК и снижение количества лимфоцитов, экспрессирующих Bcl-2 (64,37±4,9%, Р<0,05 с контролем и до лечения), при этом экспрессия CD-95-L повысилось (9,6±1,7%, Р<0,05 с контролем и до лечения ), что знаменовало нарастание апоптотической готовности иммуноцитов и начало формирования клинической ремиссии ЯК.

В  этот же срок синтез  цитокина ФНО-α в МНК (спонтанный и стимулированный) снизился, но не до контрольных значений (2,1±0,23 и 3,1±0,07 нг/2х10⁶ клеток соответственно, Р<0,05 с контролем и до лечения).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что развитие иммунопатологического процесса при ЯК сопровождается нарастанием продукции провоспалительных медиаторов, в частности, ФНО-α и ИЛ-1β,  и нарушением процесса апопотоза иммунокомпетентных клеток.

В настоящее время активно изучаются механизмы, посредством которых ингибиторы ФНО-α подавляют продукцию провоспалительных факторов, в частности провоспалительных нейропептидов и цитокинов. Инфликсимаб, обладая высокой аффинностью к ФНО-α, быстро связывается и образует устойчивое соединение с обеими его формами (растворимой и трансмембранной), снижает его функциональную активность и подавляет воспалительную реакцию в кишечнике  [2,6,8].

Считаем, что позитивное влияние инфликсимаба при ЯК связано с нейтрализацией растворимого ФНО-α, восстановлением баланса цитокинов с различной биологической направленностью, частичной нормализацией эндотелиальная дисфункция и преодолением резистентности иммуноцитов к факторам апоптоза. Возможно, нейтрализация растворимого ФНО-α,  стимулирующего активизацию фактора транскрипции – белка семейства NFkB, приводит к редукции антиапоптотического механизма в иммуноцитах и клетки подвергаются апоптозу посредством взаимодействия рецепторов Fas/Fas-L.

Следовательно, целевое воздействие на базовые молекулярные патогенетические механизмы  (таргетная терапия) представляется одной из наиболее перспективных методов лечения ЯК.

Выводы:

1. Высокой степени клинической активности ЯК соответствует повышенная экспрессия Bcl-2 лимфоцитами крови и низкая CD-95-L.
2. При тяжелом течении ЯК спонтанный и стимулированный синтез ФНО-α  и ИЛ-1β МНК повышен.
3. Индукционный курс инфликсимабом способствует нарастанию апоптотической готовности лимфоцитов, нормализации продукции ИЛ-1β, снижению синтеза  ФНО-α МНК, что сочетается с позитивной динамикой заболевания.

Литература

1. Воробьев Г.И., Халиф И.Л. Неспецифические воспалительные заболевания кишечника / М.: Миклош, 2008. –  400 с.
2. Павленко В.В., Александрова С.Б., Кораблина Н.В. Влияние инфликсимаба на некоторые показатели провоспалительных цитокинов и нейропептидов при язвенном колите/ 2015 - №4 – С.66-69
3. Павленко В.В., Катаганова Г.А. Некоторые показатели воспаления при язвенном колите как маркеры клинического ответа на биологическую терапию.//Международный научный институт «Educato». -2015 - №3- Т.10- С.121-124
4. Шалыгин Ю.А. Колопроктология. М. ГЭОТАР: Медицина - 2015. – С. 363-395
5. Baumgart D.C., Carding S.R. Inflammatory bowel disease:  cause and immunobiology/ Lancet -2007 – V/369- P.1627–1640.
6. Danese S. New therapies for inflammatory bowel disease:    from the bench to the bedside/ Gut – 2012 – V.61 – P. 918–932.
7. Engel, M.A. Neurath M.F. New pathophysiological insights and modern treatment of IBD/ J Gastroenterol – 2010 – V. 45 – P.571–583
8. Oussalah A., Evesque L., Laharie D, et al. A multicenter  experience with infliximab for ulcerative colitis: outcomes and predictors of response, optimization, colectomy, and hospitalization/ Am J Gastroenterol – 2010 - V. 105 – P.2617–2625
9. Xu XR, Liu CQ, Feng BS, et al. Dysregulation of mucosal immune response in pathogenesis of inflammatory bowel disease./ World J. Gastroenterol.  – 2014- V.20 –P. 3255–3264.

References

1. Vorob'ev G.I., Halif I.L. Nespecificheskie vospalitel'nye zabolevanija kishechnika / M.: Miklosh, 2008. – 400 s.
2. Pavlenko V.V., Aleksandrova S.B., Korablina N.V. Vlijanie infliksimaba na nekotorye pokazateli provospalitel'nyh citokinov i nejropeptidov pri jazvennom kolite/ 2015 - №4 – S.66-69
3. Pavlenko V.V., Kataganova G.A. Nekotorye pokazateli vospalenija pri jazvennom kolite kak markery klinicheskogo otveta na biologicheskuju terapiju.//Mezhdunarodnyj nauchnyj institut «Educato». -2015 - №3- T.10- S.121-124
4. Shalygin Ju.A. Koloproktologija. M. GJeOTAR: Medicina - 2015. – S. 363-395
5. Baumgart D.C., Carding S.R. Inflammatory bowel disease: cause and immunobiology/ Lancet -2007 – V/369- P.1627–1640.
6. Danese S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside/ Gut – 2012 – V.61 – P. 918–932.
7. Engel, M.A. Neurath M.F. New pathophysiological insights and modern treatment of IBD/ J Gastroenterol – 2010 – V. 45 – P.571–583
8. Oussalah A., Evesque L., Laharie D, et al. A multicenter experience with infliximab for ulcerative colitis: outcomes and predictors of response, optimization, colectomy, and hospitalization/ Am J Gastroenterol – 2010 - V. 105 – P.2617–2625
9. Xu XR, Liu CQ, Feng BS, et al. Dysregulation of mucosal immune response in pathogenesis of inflammatory bowel disease./ World J. Gastroenterol. – 2014- V.20 –P. 3255–3264.

[/box}